miR-200b通过靶向调控Ets-1对白介素-1β诱导胰岛β细胞损伤的保护作用

王英南 陈 康 葛晓春 韩桂艳 高英杰

(承德医学院附属医院内分泌科,河北 承德 067000)



miR-200b通过靶向调控Ets-1对白介素-1β诱导胰岛β细胞损伤的保护作用

王英南 陈 康1葛晓春 韩桂艳 高英杰

(承德医学院附属医院内分泌科,河北 承德 067000)

目的 探讨miR-200b靶向Ets-1对白介素(IL)-1β诱导胰岛β细胞损伤的保护作用。结果 体外培养大鼠胰岛β细胞株RINm5F，采用IL-1β诱导RINm5F细胞损伤，将RIN-m5F细胞分为对照组、损伤组(0.5 ng/ml IL-1β)、空转染组(0.5 ng/ml IL-1β+空载体)和过表达组(0.5 ng/ml IL-1β转染+miR-200b mimics)，采用qRT-PCR检测转染48 h各组的miR-200b和Ets-1 mRNA水平，采用MTT法、FITC-AnnexinV/PI双染流式细胞术及酶联免疫吸附法检测各组转染12、24、48及72 h的细胞存活率、凋亡率及胰岛素水平，检测各组细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)水平、总抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果 与对照组相比，损伤组、空转染组的miR-200b水平降低，Ets-1 mRNA水平升高，但过表达组的miR-200b水平升高，Ets-1 mRNA水平降低(P<0.05)。损伤组、空转染组转染后的存活率、上清液胰岛素水平及GSH-Px、T-AOC和SOD活性低于对照组，MDA水平和凋亡率高于对照组(P<0.05)；过表达组的以上指标均优于对照组(P<0.05)，但与对照组均有统计学差异(P<0.05)。结论 上调miR-200b水平对IL-1β诱导胰岛β细胞损伤有保护作用，主要表现在提高细胞存活、促进胰岛素分泌及改善氧化应激，可能与其靶向作用Ets-1有关。

miR-200b；Ets-1；胰岛β细胞损伤

目前临床上常用的口服降糖药长期使用会产生抗性，很难从根本上解决胰岛β细胞功能障碍和胰岛素抵抗的问题〔1〕。胰岛β细胞功能障碍是1型和2型糖尿病的共同特征，而加强对β细胞的保护是提高糖尿病治疗效果的关键。转录因子Ets-1属于Ets家族，该家族成员都具有能与DNA结合的Ets结构域，特异性识别结合嘌呤丰富的DNA靶心序列GGAA/T〔2〕。新近研究发现转录因子Ets-1在糖尿病发生发展中发挥作用〔3〕，如高糖刺激可引起胰岛β细胞内的Ets-1表达量升高，干扰Ets-1可部分恢复高糖诱导GSIS功能障碍和胰岛素含量降低。miR-200b可通过靶向Ets-1发挥对血管内皮细胞的血管生成反应〔4〕。本研究旨在研究miR-200b靶向Ets-1对胰岛β细胞损伤是否有保护作用，并上调miR-200b水平观察对白介素(IL)-1β损伤胰岛β细胞存活、凋亡及氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 大鼠胰岛素瘤细胞系RINm5F购自ATCC公司，胎牛血清及RPMI1640培养基均购自美国Hyclone公司，LipofectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司，miR-200b mimics购自美国Applied Biosystems公司，四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国sigma公司，FITC-AnnexinV/PI凋亡检测试剂购自美国Pharmingen公司，SYBR®Green Realtime PCR Master Mix购自Toyobo公司，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程公司。主要仪器：FACScan流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司，二氧化碳细胞培养箱购自日本 SANYO公司，Model 550型酶标仪购自 Bio-Rad公司，Prism 7000型定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 细胞培养 复苏冻存的RINm5F细胞，置于含10%胎牛血清、10 mmol/L HEPES，2 mmol/L L-谷氨酰铵、1 mmol/L丙酮酸钠、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，于37℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞长到70%～80%融合时消化传代。

1.3 分组及转染 取对数生长期RINm5F细胞，采用0.5 ng/ml IL-1β诱导RINm5F细胞损伤，将RINm5F细胞分为对照组、损伤组(0.5 ng/ml IL-1β)、空转染组(0.5 ng/ml IL-1β+空载体)和过表达组(0.5 ng/ml IL-1β转染+miR-200b mimics)。对照组不作任何处理，空转染组和过表达组分别于给予IL-1β处理后按照Lipofectamine 2000说明书分别转染空载体或miR-200b mimics。

1.4 qRT-PCR检测 分别于转染48 h后参照试剂盒说明书检测各组RINm5F细胞的miR-200b和Ets-1水平。使用Premier Primer5设计软件参照文献设计miR-200b和Ets-1的引物序列。总转录体系为20 μl：cDNA模板2.0 μl(1∶10稀释)、上下游引物各4 pmol和10 μl 1×SYBR®Green Realtime PCR Master Mix，ddH2O补齐。反应条件：预变性95℃ 1 min，接着进行40个循环的扩增(95℃ 15 s，60℃ 15 s，和72℃ 45 s)。采用Ct值法(2-△△CT)表示miR-200b和Ets-1的相对表达量。

1.5 MTT法检测各组的细胞活力 根据分组按每孔100 μl接种于96孔板中，以上每孔均设置4个平行复孔，分别于转染12、24、48和72 h后向每孔加入5 g/L的MTT 溶液20 μl，37℃孵育4 h后吸弃培养液，每孔加入150 μl DMSO，震荡10 min使结晶物充分溶解，采用酶标仪在490 nm波长处测定各孔的光密度(OD)值，以对照组为参考，计算其余各组A值与对照组的比值以此计为存活率。实验重复3次。

1.6 凋亡率检测 于相应处理后12、24、48和72 h后收集细胞1×106个，经PBS冲洗及Binding Buffer悬浮后使其浓度为1×106/ml，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，避光反应15 min后上流式细胞仪测定检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.7 胰岛素水平及氧化应激相关指标检测 收集转染48 h后的各组细胞及培养上清液，采用试剂盒检测各组细胞GSH-Px、T-AOC和SOD活性及MDA水平，检测细胞上清液中的胰岛素水平，以上操作完全依据试剂盒说明书完成。实验重复3次。

1.8 统计学处理 采用SPSS16.0软件，组间比较采用方差分析，两两比较采用Bonfferoni检验。

2 结 果

2.1 各组转染后的miR-200b水平比较 以对照组的miR-200b水平为参照(1.00)，损伤组、空转染组的miR-200b水平依次为(0.31±0.07)、(0.29±0.09)，均低于对照组(P<0.05)；过表达组的miR-200b水平为(4.79±0.52)，高于对照组(P<0.05)。

2.2 各组转染后的Ets-1 mRNA水平比较 以对照组的Ets-1水平为参照(1.00)，损伤组、空转染组的Ets-1 mRNA水平依次为(2.92±0.38)、(3.14±0.44)，均高于对照组(P<0.05)；过表达组的Ets-1 mRNA水平为(0.25±0.06)，低于对照组(P<0.05)。

2.3 各组RINm5F细胞的存活率比较 以对照组为参照(100%)，损伤组、空转染组转染12、24、48及72 h的存活率均降低(P<0.05)；过表达组以上时间点的存活率均高于损伤组、空转染组，但仍低于对照组(P<0.05)。损伤组和空转染组以上时间点细胞存活率的无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组RINm5F细胞存活率比较

与对照组比较：1)P<0.05；与损伤组比较：2)P<0.05；与空转染组比较：3)P<0.05；下表同

2.4 各组RINm5F细胞凋亡率比较 损伤组、空转染组转染12、24、48及72 h的凋亡率均高于对照组(P<0.05)；过表达组以上时间点的凋亡率均低于损伤组、空转染组，但仍高于对照组(P<0.05)。损伤组和空转染组以上时间点细胞凋亡率无统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组RINm5F细胞凋亡率比较

2.5 各组RINm5F细胞上清液胰岛素水平比较 损伤组、空转染组转染12、24、48及72 h上清液胰岛素水平均低于对照组(P<0.05)；过表达组以上时间点的上清液胰岛素水平均高于损伤组、空转染组，但仍低于对照组(P<0.05)。损伤组和空转染组以上时间点上清液胰岛素水平无统计学差异(P>0.05)。见表3。

2.6 各组RIN-m5F细胞氧化应激水平比较 与对照组相比，损伤组、空转染组的GSH-Px、T-AOC和SOD活性降低，MDA水平升高(P<0.05)；过表达组的GSH-Px、T-AOC和SOD活性高于损伤组、空转染组，MDA水平低于损伤组、空转染组，但与对照组的仍有统计学差异(P<0.05)。损伤组和空转染组以上指标无统计学差异(P>0.05)。见表4。

表3 各组RINm5F细胞上清液胰岛素水平比较

表4 各组RINm5F细胞氧化应激水平比较±s,n=3)

3 讨 论

英国前瞻性糖尿病研究(UKPDS)中描画的β细胞功能曲线显示：β细胞功能随着糖尿病诊断年限的延长而进行性下降，在刚确诊时β细胞还残存大约60%，而随后无论采用何种治疗都无法避免β细胞功能进行性下降。因而从β细胞保护角度看，需要寻找更合适的治疗方法。

目前发现miR-200是一簇微RNA(miRNA)家族，其家族成员包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141及miR-429〔8〕。以上miRNA定位在基因组中的2个不同位点，其中miR-200a、miR-200b和miR-429聚集在染色体1p36，而miR-200c和miR-141定位在染色体12p13上。miR-200家族在物种间高度保守，共同调节某些细胞外刺激，如转化生长因子-β1和血小板衍生生长因子(PDGF)〔6，7〕。本研究发现经IL-1β处理后的RIN-m5F细胞出现了存活率降低、凋亡率升高及胰岛素分泌功能受抑制等表现，表明采用IL-1β诱导β细胞功能障碍对的模型建立成功，与相关报道的结果一致〔8〕。此外，本研究还发现RIN-m5F细胞经IL-1β处理后miR-200b水平降低，且其靶基因Ets-1水平升高，提示miR-200b及其靶基因在β细胞损伤过程中发挥了作用。转录因子Ets-1在糖尿病发生发展中发挥作用〔12〕，如干扰Ets-1表达可改善糖尿病小鼠胰岛的葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能，且Ets-1自身也可以结合在胰岛素基因的启动子上，从而直接下调胰岛素的转录和表达。

本研究发现，过表达miR-200b后β细胞的存活率升高，凋亡率降低，表明过表达miR-200b对IL-1β诱导的β细胞损伤有较好的逆转效果。此外，过表达miR-200b后β细胞的胰岛素分泌上升，提示miR-200b对改善β细胞功能损伤有一定效果，尽管观察终点时以上指标未达到对照组水平，但改善趋势较为明显，可能与miR-200b mimics不能持续提高miR-200b水平有关，氧化应激是导致β细胞损伤的常见因素，也是损伤的主要表现之一〔10，11〕。本研究进一步观察结果提示miR-200b对β细胞损伤伴有的氧化应激有较好的改善效果。

1 庞伯健,常艳华.胰岛素强化方法治疗成人隐匿性自身免疫性糖尿病老年患者的疗效及其对胰岛β细胞功能的影响〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(15):4247-9.

2 Rao VH,Rai V,Stoupa S,etal.Blockade of Ets-1 attenuates epidermal growth factor-dependent collagen loss in human carotid plaque smooth muscle cells〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2015;309(6):1075-86.

3 Chen F,Sha M,Wang Y,etal.Transcription factor Ets-1 links glucotoxicity to pancreatic beta cell dysfunction through inhibiting PDX-1 expression in rodent models〔J〕.Diabetologia,2016;59(2):316-24.

4 Chan YC,Khanna S,Roy S,etal.miR-200b targets Ets-1 and is down-regulated by hypoxia to induce angiogenic response of endothelial cells〔J〕.J Biol Chem,2011;286(3):2047-56.

5 Kim JS,Kurie JM,Ahn YH.BMP4 depletion by miR-200 inhibits tumorigenesis and metastasis of lung adenocarcinoma cells〔J〕.Mol Cancer,2015;14(1):173.

6 Shen A,Lin W,Chen Y,etal.Pien Tze Huang inhibits metastasis of human colorectal carcinoma cells via modulation ofTGF-β1/ZEB/miR-200 signaling network〔J〕.Int J Oncol,2015;46(2):685-90.

7 Kong D,Li Y,Wang Z,etal.miR-200 regulates PDGF-D-mediated epithelial-mesenchymal transition,adhesion,and invasion of prostate cancer cells〔J〕.Stem Cells,2009;27(8):1712-21.

8 Chen F,Zhou X,Lin Y,etal.Resveratrol prevents interleukin-1β-induced dysfunction of pancreatic β-cells〔J〕.J Biomed Res,2010;24(5):381-8.

9 陈涵枝,刘殿阁,周建东,等.Ets-1转录因子在大鼠糖尿病肾病中的作用〔J〕.哈尔滨医科大学学报,2012;46(4):340-5.

10 Usuki S,Tsai YY,Morikawa K,etal.IGF-1 induction by acylated steryl β-glucosides found in a pre-germinated brown rice diet reduces oxidative stress in streptozotocin-induced diabetes〔J〕.PLoS One,2011;6(12):e28693.

11 Park L,Min D,Kim H,etal.The combination of metallothionein and superoxide dismutase protects pancreatic β cells from oxidative damage〔J〕.Diabetes Metab Res Rev,2011;27(8):802-8.

〔2015-12-21修回〕

(编辑 徐 杰)

承德市科技支撑计划项目(No.20151049)

陈 康(1981-)，男，主治医师，主要从事内分泌疾病研究。

王英南(1979-)，女，主治医师，主要从事内分泌疾病研究。

R587.1

A

1005-9202(2016)21-5240-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.011

1 解放军总医院内分泌科