骨髓间充质干细胞移植对卵巢早衰模型小鼠卵巢功能的影响

范 雪 王爱娟 张 云 李 楠 于 洋 艾 浩

(锦州医科大学附属第三医院妇产科，辽宁 锦州 121001)



骨髓间充质干细胞移植对卵巢早衰模型小鼠卵巢功能的影响

范 雪 王爱娟 张 云1李 楠 于 洋2艾 浩

(锦州医科大学附属第三医院妇产科，辽宁 锦州 121001)

目的 探讨骨髓间充质干细胞对卵巢早衰模型小鼠的影响。方法 取ICR小鼠骨髓间充质干细胞用于细胞移植。健康ICR小鼠60只随机分为对照组、模型组、治疗组。对照组小鼠不进行任何干预，模型组和治疗组小鼠腹腔注射顺铂建立化疗性损伤小鼠卵巢早衰动物模型。治疗组造模后一次性原位注射骨髓间充质干细胞进行治疗。观察大鼠一般情况、动情周期，并测定血清中E2、FSH含量以及卵巢组织形态改变。结果 模型组小鼠动情周期紊乱，经过干细胞治疗后的小鼠动情周期基本恢复正常。与对照组比较，模型组E2下降，FSH水平升高(P<0.05)。经骨髓间充质干细胞治疗后E2上升，FSH水平下降，几近恢复正常水平。模型组滤泡大部分受到破坏，滤泡数量明显少于对照组(P<0.01)。骨髓间充质干细胞治疗后滤泡及黄体数目均明显增加(包括新形成的黄体)，与模型组比较差异显著(P<0.01)。结论 顺铂可致卵泡颗粒细胞凋亡，造成卵巢功能过早衰退，骨髓间充质干细胞通过调节血清中各激素含量，可降低顺铂对卵巢的损害，促进卵泡发育，改善并增强卵巢功能。

卵巢早衰；骨髓间充质干细胞；顺铂

卵巢早衰(POF)是由多种病因导致的卵泡功能衰竭。POF治疗棘手,近年国内外取得了应用干细胞恢复卵巢功能及生育力等方面的动物试验成果，为POF患者卵巢功能及生育功能的恢复带来了希望〔1〕。目前成体干细胞治疗包括生殖干细胞、骨髓间充质干细胞(BMSCs)和胎儿间充质干细胞的治疗，因其取材方便且不涉及伦理学标准而在实验中得到广泛应用〔2〕。有研究显示，干细胞移植治疗POF，可改变卵巢组织形态，使卵巢弹性和韧性得到一定程度上的恢复，而干细胞分泌的一些因子可改善卵泡数量和质量以及减少卵巢内凋亡细胞的作用，并借此有效改善了卵巢功能〔3,4〕。本研究拟为POF的临床治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂 健康ICR小鼠62只，清洁级，雌性，体质量28～30 g，由锦州医科大学动物实验室提供。注射用顺铂(CDDP，10 mg/支)，齐鲁制药公司生产。ELISA试剂盒均购于美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分离、纯化培养与鉴定 取2只ICR小鼠，脱臼法处死后无菌条件下取其股骨和胫骨，冲出骨髓，用含10%胎牛血清的L-DMEM培养液将骨髓制成单细胞悬液，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，通过贴壁筛选法筛选出纯度较高的骨髓间充质干细胞。原代培养5～7 d后，收集bMSCs，加入抗体，按照PE/FITC标记，CD34/44/45/105的流式细胞鉴定，证明其为bMSCs〔4〕。取第3代bMSCs，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后重悬细胞，细胞浓度调整为1×106/ml的细胞悬液，用于细胞移植注射。

1.2.2 POF模型小鼠的建立及分组 将60只ICR小鼠随机均分为三组(n=20)，对照组不做任何处理，模型组和干细胞治疗组小鼠腹腔注射顺铂6 mg/kg生理盐水配比制备小鼠早衰模型〔5〕，每天同一时间注射1次，连续注射14 d。造模期间每天进行阴道涂片，观察动情周期的变化，以确定造模成功。造模后模型组小鼠不进行任何干预。干细胞治疗组小鼠造模后用0.2%戊巴比妥钠0.1 ml麻醉，背面朝上，钝性分离筋膜，可见肾脏上方的白色脂肪垫，拖出脂肪垫找出两侧卵巢，将卵巢固定，每侧缓慢注射BMSCs 20 μl，同时注意止血，关腹后给予青霉素10万U预防感染。细胞移植后1 w检测损伤卵巢的修复情况。

1.3 观察指标

1.3.1 阴道涂片及血中激素测定 每天早、晚8：00各一次取小鼠阴道脱落细胞涂片，于光学显微镜下观察其性周期，根据脱落细胞类型按标准分析动情周期，以动情期或动情间期占总观察时间的百分比为其构成比〔6〕。在造模2 w后取各组小鼠眶静脉血，ELISA法测定血清卵泡激素(FSH)和雌二醇(E2)，严格按照说明书操作。

1.3.2 各组小鼠卵巢组织形态学观察 颈椎脱位法处死小鼠，同时取卵巢待测。收集的卵巢经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片常规苏木素-伊红(HE)染色，观察卵巢组织及卵泡的形态，同时在光学显微镜下计数黄体及各个时期滤泡数量，取平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS15.5软件行t检验。

2 结 果

2.1 阴道脱落细胞涂片 模型组小鼠动情期〔(9.4±5.2)%〕显著降低，动情间期〔(42.5±17.2)%〕延长，出现动情周期紊乱；而治疗组小鼠动情周期〔(18.9±8.7)%〕和动情间期〔(25.7±4.7)%〕与对照组〔(20.7±9.2)%、(24.0±3.5)%〕比较无显著差异(P>0.05)；治疗组与模型组比较，动情周期紊乱显著降低(P<0.05)。

2.2 各组FSH和E2含量比较 与对照组E2〔(185.25±30.30)pmol/L〕、FSH〔(0.95±0.50)pmol/L〕比较，模型组E2含量〔(127.35±22.98)pmol/L〕显著下降，而FSH含量〔(1.91±0.63)pmol/L〕显著增加(P<0.05)，治疗组E2含量〔(170.32±29.27)pmol/L〕比模型组显著升高(P<0.05)，而FSH水平〔(1.05±0.29)pmol/L〕显著降低，接近正常水平。

2.3 各组小鼠卵巢组织炎形态学分析 对照组小鼠卵巢体积较大，卵泡生长活跃，排列整齐，黄体细胞丰富，清晰可见。模型组卵泡数量明显较少，排列紊乱，形态不一，黄体数目明显减少。治疗组可见卵泡数目和黄体数量均增多，形态和数目均好于模型组，层次清晰，仅次于对照组形态。见表1，图1。

表1 各组小鼠卵巢滤泡及黄体计数比较(个，

图1 各组小鼠卵巢组织形态学观察(HE，×200)

3 讨 论

POF由多种原因引起，但最常见的原因是自体免疫功能异常，病理改变是卵泡静止、数量减少甚至消失，代之以结缔组织增生。目前临床上常以激素替代治疗为主〔7〕，但治疗效果具有一定局限性，且容易导致癌症发生。

干细胞是人体一类具有自我更新、多向分化潜能的细胞，不仅有组织细胞的再生修复作用，还有强大的免疫调节功能，给POF带来了全新的细胞再生治疗模式〔8〕。研究显示，干细胞可以通过血液循环迁徙到患者卵巢，在早衰卵巢内逐渐分化为卵巢细胞，并发挥卵巢功能，分泌雌激素。干细胞治疗可有效遏制卵巢进一步早衰，保护卵巢，重塑卵巢结构〔9〕，恢复卵巢功能，有效改善患者症状，对因缺乏雌激素而引起的骨质疏松也有很好的治疗作用。

BMSCs来源广、获取容易、扩展能力强、免疫原性低、能归巢、无医学伦理争议等优点，成为再生医学、干细胞疗法中主要选择细胞之一。同种异体细胞移植实际上是一种最强烈的免疫治疗，可降低受体的供体细胞排斥反应和降低产品潜在的同种异体反应〔10〕。本研究中模型组小鼠表现为性周期紊乱，性周期延长至7～10 d，提示这些小鼠卵巢内卵泡较正常卵泡发育缓慢。有的小鼠持续停留在动情期，而不出现动情后期的表现，这可能与小鼠POF而引起卵泡不能发育成熟或不能排卵、无黄体生成有一定相关性〔11〕。BMSCs治疗组小鼠动情周期基本回复正常，说明BMSCs有较好疗效。

本实验研究显示，BMSCs移植至早衰小鼠卵巢后可能参与调整血液激素水平，使卵泡和黄体数量增加。另外，干细胞再生的卵巢细胞也可以对脑垂体分泌的相关激素作出及时、正确的反应，使体内激素水平处于平衡状态。

1 吕晓琳,艾 浩.二仙汤对卵巢早衰免疫指标影响的临床观察〔J〕.中国妇幼保健,2016;31(9):1811-3.

2 郭 路,李 斌.干细胞应用于卵巢早衰的实验研究进展〔J〕.老年医学与保健,2015;21(6):422-5.

3 房丽红.FOXO3 a基因联合干细胞修复化疗对卵巢早衰的作用及分子机制〔J〕.辽宁医学杂志,2015;29(5):278-9.

4 Kon E,Fiardo G,Roffi A,etal.Bone regeneration with mesenchymal stem cells〔J〕.Clin Cases Miner Bone Metab,2012;9(1):24-7.

5 艾 浩,张海英,张玉立,等.二仙汤对顺铂损伤后小鼠卵巢功能调节作用研究〔J〕.天津中医药,2013;30(5):298-300.

6 Kikuehi-Taura A,Taguchi A,Kanda T,etal.Human umbilical cord provides a significant source of unexpanded mesenchymal stromal cells〔J〕.Cytotherapy,2012;14(4):441-50.

7 刘 雪,佳那提·秋瓦西,李朝曦,等.干细胞治疗卵巢早衰的进展〔J〕.医学综述,2015;21(12):2151-3.

8 Qin Y,Vujovic S,Li G,etal.Ethnic specificity of variants of the ESR1,HK3,BRSK1 genes and the 8q22.3 locus:no association with premature ovarian failure(POF)in Serbian women〔J〕.Maturitas,2014;77(1):64-7.

9 Chen Y,Qian H,Zhu W,etal.Hepatocyte growth factor modification promotes the amelioration effects of human umbilical cord mesenchymal stem cell on rat acute kidney injury〔J〕.Stem Cells Dev,2011;20(1):103-13.

10 Yong KW,Wan Safwani WK,Xu F,etal.Cryopreservation of human mesenchymal stem cells for clinical applications:current methods and challenges〔J〕.Biopreserv Biobank,2015;13(4):231-9.

11 Kilic S,Pinarli F,Ozogul C,etal.Protection from cyclophosphamide-induced ovarian damage with bone marrow derived mesenchymal stem cells during puberty 〔J〕.Gynecol Endocrinol,2014;30(2):135-40.

〔2015-11-12修回〕

(编辑 袁左鸣)

国家自然科学基金(No.81173443)；辽宁省科学计划项目(No.2010042)

艾 浩(1974-)，男，博士，教授，主任医师，主要从事卵巢早衰研究。

范 雪(1982-)，女，硕士，主治医师，主要从事妇产科疾病的诊断与治疗研究。

R71

A

1005-9202(2016)21-5222-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.003

1 北京中医药大学中医妇产科

2 锦州医科大学附属第三医院超声科