电针对高脂喂养大鼠主动脉内皮细胞JNK蛋白的影响

张弘弢 蓝丹纯 李知行 许能贵 孙 健 易 玮

(广州中医药大学，广东 广州 510405)



电针对高脂喂养大鼠主动脉内皮细胞JNK蛋白的影响

张弘弢 蓝丹纯 李知行1许能贵 孙 健2易 玮

(广州中医药大学，广东 广州 510405)

目的 观察电针对高脂喂养大鼠主动脉内皮细胞c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白的影响。方法 将24只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、电针组8只。空白组予普通饲料喂养，模型组与电针组予高脂饲料喂养。造模8 w后，空白组、模型组继续如前喂养不进行干预，电针组予针刺双侧内关、三阴交、足三里及肾俞，双侧足三里及三阴交加电。干预4 w后，用葡萄糖氧化酶法、ELISA及Western印迹检测并比较各组大鼠空腹胰岛素(FINS)、空腹血糖(FPG)、稳态模型评价的胰岛素抵抗(IR)指数(HOMA-IR)以及主动脉内皮细胞JNK蛋白的表达及其磷酸化水平。结果 与模型组比较，电针组FPG、FINS、HOMA-IR均显著降低(P<0.01)，而与空白组比较差异不显著(P>0.01)；与模型组相比较，电针组的JNK蛋白表达及其磷酸化水平显著降低(P<0.01)，与空白组比较差异不显著(P>0.01)。结论 电针治疗能调节血管内皮细胞JNK蛋白表达及其磷酸化水平，使其降至正常水平，从而改善IR大鼠的IR状态，增强IR大鼠胰岛素的敏感性。

电针；胰岛素抵抗；JNK蛋白

胰岛素抵抗(IR)在众多心血管疾病的危险因素中处于重要地位,同时也在多种代谢异常类疾病的发病过程中发挥重要作用〔1〕。而C-jun氨基末端激酶(JNK)是调节胰岛素信号转导的重要信号分子〔2〕，在IR形成过程中发挥重要作用。针灸作为我国传统医学的一部分，其多水平、双向调节的作用在改善IR方面具有优势，既往研究也证实电针能有效改善IR〔3〕。血管内皮细胞是胰岛素的重要靶器官，本研究以血管内皮细胞为靶点，通过观察大鼠血管内皮细胞空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)以及JNK蛋白及其磷酸化水平的改变，探讨并完善电针改善IR状态的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物及饲料 选用体重120～140 g的6周龄SPF级雄性SD大鼠，由广州中医药大学实验动物中心提供。饲养及实验过程在屏障实验环境之中。实验环境要求室温18℃～22℃，相对湿度40%～85%；光照：12 h明/12 h暗，照度：150～300 Lx，每日手动开关。普通饲料配方(质量比)：豆粕21%，小麦18%，麸皮10%，玉米31%，鱼粉6%，稻谷4%，蛋黄粉3%，预混料3.5%，黄豆2%，植物油1.5%，多种维生素1%，由实验动物中心提供。高脂饲料配方(质量比)：脂肪34.9%，蛋白质26.2%，碳水化合物26.3%，由实验动物中心提供D12492号饲料。实验过程遵循实验室动物护理和使用的伦理准则。

1.2 设备与试剂 SAPK/JNK抗体购买于CST厂家，FINS测定试剂盒购自默科迪亚公司；电针仪选用上海华谊医用仪器有限公司生产的G6805-2A型低频电子脉冲治疗仪(YZB/沪0735-26-2009)；一次性无菌针灸针选用华佗牌，规格：0.35 mm×13 mm。

1.3 方法

1.3.1 分组与实验操作 选用SPF级SD大鼠24只，适应性喂养1 w，随机分为正常组(8只)、高脂组(16只)。两组分别给予普通饲料，高脂饲料喂养。8 w后，检测实验动物FPG、FINS，计算IR指数(HOMA-IR)，以评测模型是否成功建立。模型建立成功后，模型组随机分为模型组(8只)、电针组(8只)。电针组，取双侧足三里、三阴交、内关、肾俞，疏密波(密波50 Hz，疏波2 Hz，频率10次/min)，强度以大鼠后肢轻微抖动为度，20 min/次，1次/d，持续4 w。空白组与模型组采用与电针组相同的按压固定时间，其余不做干预，继续如前喂养。

1.3.2 标本采集与检测 针刺疗程治疗结束后，禁食不禁水12 h，于次日晨麻醉后行眼眶静脉窦采血。FPG用葡萄糖氧化酶法测定;FINS采用酶联免疫吸附法(ELISA)，按说明书进行操作测定;脱臼法处死，并从腹主动脉灌注多聚甲醛固定，快速取主动脉置于-20℃保存，Western印迹方法检测SAPK/JNK蛋白表达及其磷酸化水平。HOMA-IR参照Haffner简化Matthews的计算方法〔4,5〕，即HOMA-IR=ln(FPG×FINS/22.5)。

1.4 统计方法 采用SPSS19.0软件，采用单因素方差分析，方差齐用LSD比较，若方差不齐用Tamhane比较。

2 结 果

2.1 电针对大鼠IR的影响 与空白组相比，模型组的FPG、FINS、HOMA-IR显著升高(P<0.01)；而电针治疗后，电针组的FPG、FINS、HOMA-IR较模型组显著降低(P<0.01)。见表1。

2.2 电针对主动脉内皮细胞JNK蛋白的表达及其磷酸化水平的影响 与空白组比较，模型组的JNK蛋白及其磷酸化水平显著升高(P<0.01)；治疗后，电针组的JNK蛋白及其磷酸化水平较模型组显著降低(P<0.01)。见表2。见图1。

表1 各组大鼠FPG、FINS及HOMA-IR的比较

与空白组比较:1)P<0.01，与模型组比较:2)P<0.01；下表同

表2 各组大鼠JNK蛋白及其磷酸化水平比较

图1 3组主动脉内皮细胞JNK及p-JNK蛋白表达

3 讨 论

IR与多种代谢异常类疾病的发病密切相关，而JNK蛋白则在IR形成过程中发挥重要作用。胰岛素信号转导过程中，胰岛素与靶细胞表面的胰岛素受体结合，使胰岛素受体β亚基酪氨酸激酶发生磷酸化而被激活，激活后的酪氨酸激酶能磷酸化IRS，进而激活磷脂酰肌醇3-激酶活性以调节不同的代谢通路〔6〕。IRS是胰岛素信号转导过程中的重要组成部分和关键环节。JNK是MAPK超家族中的一员，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。JNK被激活后，能引起IRS-1第307位丝氨酸磷酸化，使IRS-1对胰岛素信号的转导起负向调节，减弱机体组织对胰岛素的敏感性〔7〕。在2型糖尿病患者和糖尿病、非酒精性肝炎等多种代谢异常疾病的实验动物模型中，均能发现其组织中的JNK活性明显升高。而无论是通过JNK结构域反义多肽序列抑制JNK蛋白活化、JNK基因敲除，还是RNAi技术沉默JNK基因的表达，均能发现实验动物模型组织胰岛素敏感性明显提高，IR状态显著改善〔8〕。IR在传统中医理论中认为其病机乃 “脾肾两虚、痰瘀阻络”，治疗原则为标本兼治，治法当培补脾肾、祛痰化瘀通络。故选取足三里、内关、三阴交、肾俞穴为主穴治疗。足三里是足阳明胃经中五腧穴之合穴且为胃之下合穴，能健脾化痰，补益中气；内关为手厥阴心包经的络穴，与三焦经相通，能理脏腑之气机；三阴交为足厥阴肝、足太阴脾、足少阴肾三条阴经的交会穴，联络三条经络之气血，能调补肝肾，健脾益气，疏经通络。肾俞是足太阳膀胱经中肾之背俞穴，能补先天之肾气。且其中足三里、三阴交、内关三穴是靳瑞教授在临床上治疗糖尿病、肥胖等代谢异常疾病有显著疗效的经验组穴。诸穴标本兼治，共奏“培补脾肾、祛痰化瘀通络”之功。

电针改善IR的内在机制可能与其干预胰岛素信号转导通路有关。研究发现，针刺胰岛素抵抗鼠，其骨骼肌IRS-1、IRS-2的表达增多，且骨骼肌PI3K-p85α mRNA及其蛋白的表达被抑制，而PI3K的活性增强；同时IR鼠骨骼肌中phospho-PKCζ/λ mRNA和Akt2 mRNA的表达亦有增加，从而改善大鼠骨骼肌的IR状态〔9,10〕。亦有研究表明，电针通过干预IR大鼠骨骼肌JNK蛋白的表达，降低JNK的活性，减少胰岛素受体底物磷酸化，从而改善IR状态〔11〕。近年来，作为胰岛素的重要靶器官之一的血管内皮细胞备受关注，关于针刺改善血管内皮细胞IR的研究也日益增多，如陈婧〔12〕通过针刺自发性IR模型——OLETF大鼠，观察血管内皮细胞与IR的变化发现，针刺干预下调了IR模型大鼠TNF-α的表达,同时抑制MAPK-P38信号通路的激活,从而进一步降低TNF-α的表达,使胰岛素受体的活性增强,机体对胰岛素的敏感性亦有增强。为进一步完善其作用机制，结合以上研究，考虑电针改善血管内皮IR是否与JNK蛋白有关。 本次实验结果说明电针能有效改善实验大鼠IR状态，再次验证了既往的研究结果。高脂饮食喂养大鼠，经多种途径激活了大鼠血管内皮细胞的JNK，使JNK蛋白表达及其磷酸化水平明显增加，从而干预胰岛素信号传导通路，引起大鼠IR。电针治疗能调节血管内皮细胞JNK蛋白表达及其磷酸化水平，使其降至正常水平，从而改善IR大鼠的IR状态，增强IR大鼠胰岛素的敏感性。

1 陈春红,傅向华.胰岛素抵抗与冠心病的关系及其机制的研究进展〔J〕.河北职工医学院学报,2006;23(2):47.

2 Sharfi H,Eldar-Finkelman H.Sequential phosphorylation of insulin receptor substrate-2 by glycogen synthase kinase-3 and c-Jun NH2-terminal kinase plays a role in hepatic insulin signaling〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab,2008;294(2):E307-15.

3 王静芝，王 华，周焕娇，等.电针对胰岛素抵抗模型大鼠下丘脑IRS-2和Akt2 mRNA表达的影响〔J〕.中华中医药杂志，2014；10：3243-6.

4 Matthews DR,Hosker JP,Rudenski AS,etal.Homeostasis model assessment:insulin resistance and beta-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man〔J〕.Diabetologia,1985;28(7):412-9.

5 Haffner SM,Kennedy E,Gonzalez C,etal.A prospective analysis of the HOMA model.The Mexico City Diabetes Study〔J〕.Diabetes Care,1996;19(10):1138-41.

6 Yang R,Trevillyan JM.c-Jun N-terminal kinase pathways in diabetes〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2008;40(12):2702-6.

7 赵 斌.JNK通过抑制胰岛素信号通路介导了高糖和软脂酸诱导的胰岛β细胞凋亡〔D〕.上海：上海交通大学,2008.

8 Hirosumi J,Tuncman G,Chang L,etal.A central role for JNK in obesity and insulin resistance〔J〕.Nature,2002;420(3):333-6.

9 张 梁,易 玮.针刺对胰岛素抵抗模型大鼠骨骼肌胰岛素受体底物和葡萄糖转运蛋白4的影响〔J〕.广州中医药大学学报,2015;(4):699-704.

10 张 梁.针刺对胰岛素抵抗模型大鼠干预的信号转导机制研究〔D〕.广州：广州中医药大学,2010.

11 唐思诗,唐念珍,唐成林,等.电针刺激对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌ERK及JNK蛋白表达的影响〔J〕.实用中医药杂志,2015；30(4):268-70.

12 陈 婧.针剌对胰岛素抵抗模型大鼠血管内皮MAPK-P38信号通路的影响〔D〕.广州：广州中医药大学,2015.

〔2016-07-26修回〕

(编辑 曲 莉)

Effect of electroacupuncture on the expression of JNK protein in aorta of rats with high fat induced insulin resistance

ZHANG Hong-Tao,LAN Dan-Chun,LI ZHi-Xing,et al.

Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510405,Guangdong,China

Objective To investigate the effect of electroacupuncture(EA)on the expression of JNK protein in aorta of rats with high fat induced insulin resistance.Methods 24 male SD rats were randomly divided into blank,model and EA groups,with 8 rats in each group.Rats in blank group were fed with normal diet,rats in model and EA groups were fed with high fat diet.After 8 weeks,rats in EA group were applied to bilateral Neiguan(PC6),Zusanli(ST36),Sanyinjiao(SP6)and Shenshu(BL23)for 4 weeks.Needles in Zusanli(ST36),Sanyinjiao(SP6)were connected with EA.At the end of the treatment,glucose oxidase method and ELISA were used to detect the fasting plasma glucose(FPG),fasting serum insulin(FINS)and homeostasis model assessment-insulin resistance(HOMA-IR)was calculated.The expression of JNK protein and the phosphorylation protein were determined by using Western blot.Results Compared with model group,the FPG,FINS and HOMA-IR in the EA group were significantly decreased(P<0.01).After treatment,the FPG,FINS and HOMA-IR in the EA group were significantly lower than those of model group(P<0.01)and the expression of p-JNK/JNK of rats in EA group was significantly decreased than that of model group(P<0.01).Conclusions EA could improve insulin sensitivity of rats with high fat induced insulin resistance,which might be related to regulating the expression of JNK protein and its phosphorylation level.

Electroacupuncture;Insulin resistance;JNK protein

国家自然科学基金资助项目(No.81273845)

易 玮(1966-)，女，教授，博士生导师，主要从事针灸治疗代谢性疾病研究。

张弘弢(1992-)，男，在读硕士，主要从事针灸治病机制研究。

R245.31+1

A

1005-9202(2016)21-5220-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.002

1 深圳市中医院 2 广东省中医院