一测多评法测定败酱草中3种三萜类成分

涂正伟，李东华，关鑫，鹿燕敏，高颖华

一测多评法测定败酱草中3种三萜类成分

涂正伟1，李东华1，关鑫1，鹿燕敏1，高颖华2

目的：建立HPLC同时测定败酱草中齐墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元3种三萜类成分的“一测多评”法。方法：以齐墩果酸为内参物，采用HPLC测定含量，建立其与熊果酸和常春藤皂苷元的相对校正因子（RCF），以相对保留时间（RRT）进行色谱峰定位，计算熊果酸和常春藤皂苷元的量；用外标法测定6批次败酱草中熊果酸和常春藤皂苷元的量，比较计算值与实测值的差异，验证一测多评的可行性和重现性。结果：测得熊果酸和常春藤皂苷元的平均相对校正因子为0.860（RSD 1.24％）、0.934（RSD 0.79％）；在不同HPLC和色谱柱下，熊果酸和常春藤皂苷元RCF的RSD分别为0.85％、0.72％，RRT的RSD分别为0.71％、1.07％；熊果酸和常春藤皂苷元的计算值和实测值之间的夹角余弦值分别为0.999 97和0.999 89，两种方法所测得的两种成分的含量相对偏差都在±5％以内。结论：一测多评法用于败酱草的三萜类多成分含量测定准确可行，重现性好。

一测多评法；高效液相色谱；败酱草；三萜类成分

败酱草为败酱科败酱属植物黄花败酱Patrinia scabiosaefolia Fisch.ex Trev.和白花败酱Patrinia Vil⁃losa(Thunb.)Juss.的全草。具有清热解毒、破瘀排脓的功效，主治肠痈、肺痈、热毒痈肿、痢疾和产后瘀滞腹痛[1-2]。吴咸中院士将其与大黄、黄芩、白头翁组成清热解毒方长期用于临床治疗化脓性阑尾炎、阑尾脓肿以及其他多种原因引起的腹腔感染甚或出现MODS者，取得了很好的治疗效果。本课题组研究发现清热解毒方可以改善脓毒症大鼠的肝、肾及血小板功能，其中败酱草在提高存活率及降低血小板活化方面发挥重要的作用[3]。败酱草主要含三萜类成分，其中主要活性成分是以齐墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元为苷元的皂苷。有研究采用HPLC技术以外标法同时测定了败酱草中齐墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元3种三萜类成分含量[4]，但考虑到日常检测中使用三种对照品的高成本，本文试图建立以1种对照品来快速准确测定败酱草中3种三萜类成分的“一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）”。即在多指标质量评价时，以药材中某一典型组分（有对照品供应者）为内标，建立该组分与其他组分之间的相对校正因子（relative correction factor，RCF），通过校正因子计算其他组分的含量的方法[5]。

1 材料与方法

1.1 材料高效液相色谱仪（Aglient1100，美国安捷伦公司），高效液相色谱仪（Dionex Ultimate3000，美国戴安公司），分析天平（BP211D，德国赛多利斯公司），旋转蒸发器（RE-52AA，上海雅荣生化仪器设备有限公司），恒温数控超声波清洗器（KQ-700GDV，昆山市超声仪器有限公司）。常春藤皂苷元对照品（中国药品生物制品检定所，批号111733-201205），齐墩果酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号110709-200505），熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110742-200517)。分别自河北安国和安徽亳州各采购3批次败酱草样品，经南开医院草药房赵玉均老师鉴定，其中安国购买的第1批次和亳州购买的第3批次为白花败酱，其余均为黄花败酱。甲醇（天津市康科德科技有限公司）为色谱纯试剂，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件色谱柱为Phenomenex Synergi 4μ Hydro-RP（250×4.6 mm，80A）、Dionex Acclaim120 C18（5μm，250×2.1 mm）、Kromasil C18（5μm，250× 4.6mm），后两者仅2.3项下使用；以甲醇-0.5％醋酸铵（87∶13）为流动相，流速为1 mL/min，DAD检测波长为210 nm，柱温为30℃。

1.2.2 对照品溶液的制备取齐墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，制成每毫升含265.0μg齐墩果酸、250.0μg熊果酸、122.5μg常春藤皂苷元的混合对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备将败酱草药材粉碎过20目筛，取2 g药材粉末，精密称定，精密量取50mL甲醇，超声30min，过滤，弃去开始少量滤液，精密量取续滤液25 mL置于茄形烧瓶中，减压蒸干。向蒸干的残渣中加15 mL甲醇、1 mL浓盐酸，80℃下回流反应4 h，反应完将反应液减压蒸干。加5 mL水悬浮，转移至分液漏斗，用氯仿萃取3次，每次15mL，合并氯仿层，减压蒸干。将蒸干的样品用少量甲醇溶解，转移至10mL容量瓶定容，混匀，吸取1mL样品溶液于12 000 r/min离心10min，取上清液即得供试品溶液。

1.2.4 标准曲线的制备精密吸取上述混合对照品溶液2、4、8、12、16、20μL注入液相色谱仪，按1.2.1项下HPLC条件测定。以对照品质量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算得回归方程和线性范围。

2 结果

2.1 HPLC方法考察

2.1.1 系统适用性在本实验条件下，齐墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元的峰形良好，相互之间及与供试品溶液中其他物质分离度良好，具有较好的专属性，保留时间分别约为17.3 min、18.3 min和7.4 min，见图1。

图1 败酱草样品（A）和对照品（B）的HPLC图谱

2.1.2 线性关系按1.2.4项下方法绘制标准曲线并进行回归计算得齐墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元的回归方程分别为：Y=461.2X-5.873（r=0.999 5）、Y=396.2X-4.538（r=0.999 5）和Y=432.0X-3.307（r= 0.999 5），齐墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元分别在0.53～5.30μg、0.50～5.00μg和0.245～2.45μg范围内线性关系良好。

2.1.3 精密度试验精密吸取1.2.2所制混合对照品溶液20μL，连续进样6次，记录峰面积，齐墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元峰面积的RSD值分别为0.37％、0.73％和0.86％。

2.1.4 稳定性试验取同一供试品溶液分别于0、2、6、12、18、24 h进样分析，记录峰面积，计算齐墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元峰面积的RSD值分别为0.89％、2.04％和1.27％，表明供试品溶液室温放置24 h稳定。

2.1.5 重复性试验取2 g败酱草药材粉末，共6份，精密称定，按1.2.3项下方法制备样品，测定齐墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元的平均含量为2.056、1.982和0.240 mg/g药材，RSD值分别为3.94％、3.97％和2.43％。

2.1.6 加样回收率取已知含量的败酱草药材粉末6份，每份2 g，精密称定，分别精密加入齐墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元对照品适量，按1.2.3项下方法制备样品溶液，按1.2.1项下HPLC条件测定。齐墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元的平均回收率为97.32％、98.04％和97.56％，RSD值分别为3.12％、2.56％和2.21％。

2.2 相对校正因子测定依据被测物质的进样质量(m)与其色谱峰面积(A)成正比关系，即m=f·A。以齐墩果酸（OA）为内标，熊果酸（UA）和常春藤皂苷元（H）的RCF分别为[6]：，结果见表1。

表1 熊果酸和常春藤皂苷元的相对校正因子考察

2.3 相对校正因子重现性考察按1.2.4项下条件，考察不同色谱柱及高效液相色谱仪对相对校正因子和待测物与内标的相对保留时间(relative retention time，RRT）的影响，按2.2项下公式计算，结果见表2。

表2 不同HPLC和色谱柱下熊果酸和常春藤皂苷元的RCF和RRT重现性考察

2.4 样品测定取自河北安国和安徽亳州购买的6批次败酱草样品，按照1.2.3项下供试品溶液处理方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品、混合标准品20μL按1.2.1项下HPLC方法进样分析。分别采用外标法和QAMS法计算6批次败酱草样品中熊果酸和常春藤皂苷元的含量，结果见表3。

2.5 一测多评法与外标法结果的比较研究将外标法实测含量与QAMS计算的含量采用夹角余弦值进行比较。夹角余弦值计算公式

结果显示，两种方法测得的熊果酸和常春藤皂苷元的计算值和实测值之间的夹角余弦值分别为0.999 97和0.999 89，两种方法测得含量没有显著性差异，且两种方法所得的含量相对偏差都在±5％以内。

3 讨论

败酱草主要含三萜皂苷类成分，其中主要活性成分是以齐墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元为苷元的皂苷，这些皂苷在经历胃肠道时会部分水解成苷元齐墩果酸和常春藤皂苷元[7-9]。熊果酸对二甲苯引起的小鼠耳肿胀有很强的抗炎作用，齐墩果酸和熊果酸对四氯化碳引起的肝损伤有明显的保护作用。肝脏是多种病原体及其毒素的重要清除场所，因此败酱草三萜类成分对肝脏的保护作用降低了机体对感染及内毒素的敏感性，抑制了脓毒症的炎症反应[10-11]。因此本研究主要以测定三种三萜皂苷元来评价败酱草的质量。

在败酱草药材中，三萜类成分以苷和苷元两种形式存在，本研究在制备供试品溶液时通过水解步骤使三萜皂苷水解为苷元，因此测得的齐墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元含量包含了游离苷元和苷两种形式的量，能准确地反映三种三萜类成分的量。供试品溶液制备方法借鉴了2005版《中国药典》木通的方法，但经过考察考虑到正丁醇富集作用有限且难以除去，去除了正丁醇萃取的过程。另外对水解过程通过正交试验进行了重新考察确定了本研究的水解方法。

质量评价对中药生产过程极为重要，而一般说来单一成分往往无法准确反映药材的质量，但多成分评价则由于中药标准品价格昂贵大大增加了检测成本，而一测多评法恰好可以有助于解决这个问题。“一测多评法”是由王智民教授于2006年首次提出，该方法适用于对照品难得或制备成本高或不稳定的情况下同类多成分同时测定，降低中药多成分质量评价成本[12]。该法提出后，多个课题组将“一测多评法”运用到多种中药材和中成药制剂的多成分质量评价中去[13-15]，如采用一测多评法测定枇杷叶有效部位中6种三萜酸成分的量和一清胶囊中的5种大黄蒽醌类成分等。本研究选择齐墩果酸这个很常见且价格较为低廉的标准品作为内参，通过HPLC确立了和熊果酸和常春藤皂苷元的相对校正因子，准确可行、重现性较好。通过一测多评法测算的熊果酸和常春藤皂苷元含量与外标法测定的含量没有显著性差异，相对偏差均在±5％以内，说明QAMS法可以用于败酱草的三萜类多成分的质量评价。

表3 6批次败酱草药材中3种三萜类成分的含量(外标法和QAMS法)

[1]南京中医药大学编.中药大辞典（第2版）上册[M].上海：上海科学技术出版社,2006:1914-1916.

[2]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].第7册，上海：上海科学技术出版社,1999:570-574.

[3]杨静，刘洪斌，李东华.清热解毒方改善脓毒症大鼠脏器功能的比较[J].中国中西医结合外科杂志,2012,18(2):157-160.

[4]毛红梅,平欲晖,宗星星,等.HPLC同时测定败酱草中常春藤皂苷元、齐墩果酸和熊果酸的含量[J].中国实验方剂学杂志,2012, 18(15):89-92.

[5]王智民,高慧敏,付雪涛,等.“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究[J].中国中药杂志,2006,31(23):1925-1928.

[6]张勇,张玲,谢晓梅.一测多评法同时测定木瓜中2种常见三萜酸[J].中成药,2013,35(4):770-773.

[7]高亮,张琳,刘江云,等.黄花败酱的化学成分研究[J].中草药, 2011,42(8):1477-1480.

[8]万新,石晋丽,肖培根,等.败酱属植物化学成分与药理作用[J].国外医药·植物药分册,2006,21(2):53-59.

[9]夏明文,谭菁菁,杨琳,等.黄花败酱化学成分研究[J].中草药, 2010,41(10):1612-1615.

[10]鞠建华,周亮,林耕,等.枇杷叶中三萜酸类成分及其抗炎、镇咳活性研究[J].中国药学杂志,2003,38(10):752-757.

[11]林艳芹,郑薇,黄鹤光.熊果酸对急性肝损伤动物模型作用的研究[J].福建医药杂志,2014,36(4):63-65.

[12]王智民,钱忠直,张启伟,等.一测多评法建立的技术指南[J].中国中药杂志,2011,36(6):657-658.

[13]蔡雪萍,李振华,华俊磊,等.一测多评法测定枇杷叶有效部位中6种三萜酸成分的量[J].中草药,2013,44(21):3057-3062.

[14]何兵,刘艳,杨世艳,等.一测多评同时测定款冬花中10个成分的含量[J].药物分析杂志,2013,33(9):1518-1524.

[15]王小平,王芳,龙凯花,等.一测多评法测定一清胶囊中的5种大黄蒽醌类成分[J].华西药学杂志,2014,29(5):591-593.

（收稿：2016-01-26修回：2016-05-20）

（责任编辑 刘洪斌）

Determ ination of Three Triterpenoids Com ponents Content in Herba Patriniae w ith QAMS

TU Zheng-wei,LIDong-hua,GUAN Xin,et al.Tianjin Institute of Integrative Medicine for Acute Abdominal Dis⁃eases,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin(300100),China

Objective To establish a quantitative analysis method ofmulti-components by single-marker (QAMS)for determinating oleanolic acid，ursolic acid and hederagenin simultaneously in Herba Patriniae by HPLC.M ethods The content of internal reference substance Oleanolic acid was determined by HPLC,and the relative correlation factors(RCF)of oleanolic acid and ursolic acid,oleanolic acid and hederagenin were es⁃tablished.The chromatographic peaks of ursolic acid and hederagenin were located by the relative retention time (RRT).The contents of the two determinands were calculated according to the respective RCF and the injection content of oleanolic acid.The contents of ursolic acid and hederagenin in 6 batches Herba Patriniae were deter⁃mined in the external standard method and were contrasted with the calculated value to verify the feasibility and repeatability of the QAMSmethod.Results The RCF of ursolic acid and hederagenin with reference to Olea⁃nolic acid were 0.860（RSD 1.24％）and 0.934（RSD 0.79％）respectively.In different HPLC and column,the RSD of the RCF were 0.85％and 0.72％respectively,and the RSD of the RRT were 0.71％and 1.07％respec⁃tively.The included angle cosine value between the calculated and themeasured value of ursolic acid and heder⁃agenin were 0.999 97and 0.999 89 respectively,and the relative deviation of the contents in two methods all were less than±5％.Conclusion The QAMS is a kind of accurate and feasiblemethod to determine the con⁃tents of themulti-components simultaneously in Herba Patriniae．

Quantitative analysismethod ofmulti-components by single-marker；HPLC；herba Patriniae；triterperioids

R285.5

A

1007-6948(2016)05-0479-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.05.017

天津市卫生局基金资助项目（11020）

1.天津市中西医结合急腹症研究所（天津300100）

2.天津市医药科学研究所（天津300700）

涂正伟，E-mail:tuzhengwei132912@163.com