片仔癀抑制淋巴管新生的作用及其机制研究
2016-12-06冯健愉靳祎祎严兆坤赖子君彭军林久茂
冯健愉,靳祎祎,严兆坤,赖子君,彭军,林久茂
(1.福建中医药大学中西医结合研究院,福建福州350122;2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室,福建福州350122)
片仔癀抑制淋巴管新生的作用及其机制研究
冯健愉1,2,靳祎祎1,2,严兆坤1,2,赖子君1,2,彭军1,2,林久茂1,2
(1.福建中医药大学中西医结合研究院,福建福州350122;2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室,福建福州350122)
目的研究片仔癀(PZH)体外对淋巴管新生的抑制作用及其机制。方法体外培养人淋巴内皮细胞(HLEC),分成对照组及PZH低、中、高剂量组,倒置显微镜观察细胞形态变化;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;Transwell观察细胞迁移;Tube Formation观察细胞管腔形成;W estern Blot检测细胞促淋巴管新生相关因子蛋白表达。结果PZH低、中剂量组对HLEC的细胞形态、周期、凋亡无明显影响,而PZH高剂量组具有降低细胞密度、诱导HLEC凋亡、增加G0/G1期细胞比例和降低S期细胞比例的显著作用(P<0.05);PZH可显著降低HLEC的迁移能力和管腔形成能力,且呈现一定的剂量依赖;PZH明显下调HLEC中VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1和MMP-3/10的蛋白表达(P<0.05)。结论PZH体外对HLEC的淋巴管新生有显著抑制作用,通过抑制VEGFC、VEGFR-3、MMP-1和MMP-3/10等表达是其抑制淋巴管新生的重要作用机制。
片仔癀;淋巴内皮细胞;淋巴管新生
淋巴管新生(lymphangiogenesis)是肿瘤发生转移的重要机制[1],受到多种因子的调控,其中血管内皮生长因子C(VEGF-C)及其受体VEGFR-3和基质金属蛋白酶家族蛋白可抑制淋巴内皮细胞凋亡,促进细胞增殖、迁移及其管腔形成,并最终导致淋巴管新生[2-3]。抑制淋巴管新生已成为一种极具潜能的肿瘤治疗策略。片仔癀(Pien Tze Huang,PZH)对多种恶性肿瘤的临床疗效显著,且无明显毒副作用[4]。实验研究显示:PZH可诱导大肠癌细胞凋亡,抑制大肠癌细胞增殖、转移、耐药及肿瘤血管新生等[5-8],但未见从淋巴管新生方面探讨PZH抑制肿瘤转移的研究报道。本课题组开展了初步的研究,现报告如下。
1材料
1.1 药物和细胞株PZH由漳州片仔癀药业股份有限公司提供(生产批号:1009039);人淋巴内皮细胞(HLEC)购自广州吉尼欧生物科技有限公司。
1.2 试剂与耗材RPIM 1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰酶、青霉素-链霉素混合液(双抗,美国Thermo公司);AnnexinⅤ-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期即时检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司);Transwell板(美国Corning公司);管腔形成试剂盒(德国Merck Millipore公司);抗体(武汉三鹰生物技术有限公司);培养瓶、培养板(无锡耐思生物科技有限公司)。
1.3 主要仪器二氧化碳培养箱(美国Thermo公司);倒置显微镜系统(德国Leica仪器有限公司);流式细胞仪(FCM,美国BD公司);Trans-Blot小型转印槽转膜仪、ChemiDocXRS+化学发光成像系统(美国BIO-RAD公司)。
2方法
2.1 药物及试剂的配置PZH在研钵中研成细粉末后,用磷酸盐缓冲液(PBS)配制成20 mg/m L溶液,经高压灭菌后于-20℃贮存备用。RPMI 1640完全基础培养基含10%FBS和1%双抗,4℃冰箱保存备用。
2.2 细胞培养和分组给药HLEC用RPMI 1640完全培养基,置37℃、5%CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养,分成对照组(0 mg/mL)、低剂量组(0.25 mg/mL)、中剂量组(0.5 mg/mL)及高剂量组(0.75 mg/m L)。每组设3个复孔,各组给予相应剂量的PZH干预24 h。
2.3 HLEC生长状态观察取对数生长的HLEC接种于6孔板,经不同浓度PZH干预后,用倒置显微镜观察细胞的生长情况。
2.4 细胞周期检测采用碘化丙啶(PI)染色,流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况,按细胞周期检测试剂盒说明操作。
2.5 细胞凋亡检测采用AnnexinⅤ/PI染色,流式细胞仪检测HLEC凋亡。具体操作参照细胞凋亡检测试剂盒说明。
2.6 细胞迁移分析采用Transwell实验观察PZH对HLEC迁移能力的影响,实验操作参考Shen等[6]报道的方法,结果采用倒置显微镜观察并成像处理。
2.7 管腔形成分析采用Tube Formation实验观察PZH对HLEC管腔形成的影响,实验操作参考Shen等[7]报道的方法,结果采用倒置显微镜观察并成像处理。
2.8 蛋白表达检测采用Western Blot法检测PZH对HLEC胞浆中VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1和MMP-3/10等蛋白表达的影响,并用凝胶成像系统进行图像数据分析。
2.9 统计学处理多组实验数据间比较使用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析,数据以x±s表示。
3结果
3.1 PZH对HLEC生长的影响与对照组比较,PZH低、中剂量组HLEC密度未见明显降低,而PZH高剂量组细胞数量减少,见图1。
3.2 PZH对HLEC增殖的影响与对照组比较,PZH低、中剂量组对细胞周期无影响,而PZH高剂量组显著增加G0/G1期细胞的比例,降低S期细胞的比例,对G2/M期无影响,使细胞周期阻滞于G0/G1期。见图2。
3.3 PZH对HLEC凋亡的影响与对照组比较,低、中剂量组对细胞凋亡无明显影响,而高剂量组细胞凋亡增加。见图3。
3.4 PZH对HLEC迁移能力的影响对照组有较多的细胞穿过小孔膜,而不同浓度PZH干预后穿过小孔的细胞数量逐渐减少,呈剂量依赖作用,说明PZH能显著降低HLEC的迁移能力。见图4。
3.5 PZH对HLEC管腔形成能力的影响对照组有较多的管腔形成,而不同浓度PZH干预后能减少HLEC的管腔形成,呈剂量依赖作用,提示PZH能显著降低HLEC的管腔形成能力。见图5。
3.6 PZH对HLEC的VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1、MMP-3/10蛋白表达的影响见图6。
4讨论
据报道,PZH具有保肝[9]、改善心脑血管功能[10]等作用,临床上对多种恶性肿瘤的临床治疗有着显著的效果。前期体内外实验证实了PZH可诱导大肠癌细胞凋亡、抑制大肠癌细胞增殖、转移、耐药及肿瘤血管新生等,但其抗肿瘤转移的机制仍需进一步阐明。近期研究表明:淋巴管新生是肿瘤发生转移的主要因素和重要机制之一,研究PZH抑制淋巴管新生,可进一步揭示其抗肿瘤转移的作用机制。
淋巴管新生指在某些病理状态下,淋巴内皮细胞受趋化因子作用而迁移至局部组织,然后在内皮生长因子作用下增殖形成新的淋巴管,包括淋巴内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的过程,且该过程相当复杂,涉及许多黏附分子、蛋白溶酶、细胞因子和生长因子等的参与,其中,血管内皮生长因子-C(VEGF-C)是最重要的促淋巴管新生因子之一[11]。当VEGF-C与淋巴内皮细胞上的特异性受体VEGFR-3结合后,可通过选择性地促进淋巴细胞增殖、瘤周及瘤内新淋巴管的形成,使原有淋巴管增生、管径增加,参与淋巴管新生与肿瘤转移;也可通过激活下游多条促淋巴管新生相关通路,上调基质金属蛋白酶家族(MMPs)蛋白的表达水平,从而特异性地促进淋巴管生成,引起肿瘤转移[12]。而基质金属蛋白酶家族(MMPs)在细胞迁移过程中也发挥着重要作用[3],其中,MMP-1可由HLEC产生,溶解相应的胶原,有利于细胞的迁移;MMP-3和MMP-10属于基质溶解酶,能作用于PG(蛋白聚糖)、LN(层粘连蛋白)、FN(纤连蛋白)、Ⅲ型和Ⅳ型胶原及明胶,促进细胞迁移[13]。因此,VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1、MMP-3/10的表达与肿瘤淋巴管新生、肿瘤转移都密切相关,下调这些蛋白的表达可显著抑制肿瘤淋巴管新生与转移。
本研究以人淋巴内皮细胞(HLEC)为研究对象,用PZH对其进行干预,观察PZH对淋巴管新生的影响。结果显示:PZH低、中剂量组对HLEC的细胞形态、细胞周期、细胞凋亡无明显影响,而PZH高剂量组具有降低细胞密度、增加G0/G1期细胞比例和降低S期细胞比例、诱导HLEC凋亡的显著作用,提示高剂量PZH对抑制HLEC增殖、促进HLEC凋亡具有一定作用。PZH各剂量均可显著降低HLEC的迁移和管腔形成能力,该结果提示PZH抑制淋巴管新生并不是主要通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,而是通过抑制HLEC的迁移和淋巴管形成能力。此外,PZH能显著下调HLEC中VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1和MMP-3/10的蛋白表达,提示通过下调上述蛋白的表达是PZH抑制淋巴新生的重要作用机制。
然而,作为中药复方的PZH,其化学成分极为复杂,治疗机制具有多途径、多靶点的特点,而淋巴管新生和大肠癌淋巴结转移也是一个复杂的过程,因此后续可进一步通过多条促淋巴管新生信号通路,更系统地探讨PZH抑制大肠癌淋巴结转移的作用机制。
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R285.6
A
1000-338X(2016)04-0043-03
2016-06-05
福建省自然科学基金(2015J01337)
冯健愉(1989—),女,硕士研究生,主要从事中药抗肿瘤的机制研究。
林久茂(1975—),男,副研究员,医学博士,硕士生导师。E-mail:jiumaolin@hotmail.com