用自然周期方案、激素替代周期方案准备内膜的助孕治疗者短时和过夜培养冻胚的移植结局观察

范晓玲,王蕾,张亚凤，胡蓉

(1彩虹医院，陕西咸阳 712000;2咸阳市第一人民医院；3宁夏医科大学总医院生殖医学中心;4省部共建教育部生育力保持重点实验室)



用自然周期方案、激素替代周期方案准备内膜的助孕治疗者短时和过夜培养冻胚的移植结局观察

范晓玲1,王蕾2,张亚凤1，胡蓉3,4

(1彩虹医院，陕西咸阳 712000;2咸阳市第一人民医院；3宁夏医科大学总医院生殖医学中心;4省部共建教育部生育力保持重点实验室)

目的 观察用自然周期方案、激素替代周期方案准备内膜的助孕治疗者短时和过夜培养冻融胚胎的移植结局。方法 293对夫妇采用冷冻-复苏胚胎移植(FET)助孕治疗，共337个移植周期，根据移植前内膜准备方法分为自然周期组(NC组，采用自然周期准备方案)和激素替代周期组(HRT组，采用激素替代周期准备方案)，每组再根据胚胎解冻后体外培养时间(短时培养和过夜培养)分层，观察FET结局(种植率、临床妊娠率、流产率、多胎率)。结果 NC组、HRT组种植率分别为32.69%、21.83%，临床妊娠率分别为59.15%、41.73%，流产率分别为7.14%、16.22%，多胎率分别为21.43%、13.51%，NC组种植率和临床妊娠率高于HRT组(P均<0.05)。NC组短时培养、过夜培养种植率分别为28.13%、35.87%，临床妊娠率分别为53.57%、62.79%，流产率分别为6.67%、7.41%，多胎率分别为20.00%、22.22%，两者比较差异均无统计学意义。HRT组短时培养、过夜培养种植率分别为21.92%、21.74%，临床妊娠率分别为44.19%、39.42%，流产率分别为21.05%、11.11%，多胎率分别为12.28%、14.81%，两者比较差异均无统计学意义。NC组、HRT组短时培养FET结局比较差异无统计学意义。与HRT组过夜培养者相比，NC组过夜培养者种植率和临床妊娠率高(P均<0.05)。结论 自然周期较激素替代周期内膜准备方法可获较好FET结局,主要体现在胚胎解冻后体外培养时间选择为过夜培养时。

胚胎移植；内膜准备方法；自然周期；激素替代周期

冷冻-复苏胚胎移植(FET)作为辅助生育技术(ART)的重要组成部分，可以有效预防卵巢过度刺激综合征、多胎妊娠等体外受精-胚胎移植技术(IVF-ET)相关的并发症，增加单次促排卵的累积妊娠率及胚胎的利用率[1]。然而，与新鲜胚胎移植周期相比结局仍不理想[2]。影响冻融胚胎移植结局的因素很多，人为可控的因素主要为内膜准备方法和解冻后移植时机。本研究观察了用自然周期方案和激素替代周期方案准备内膜的助孕治疗者短时和过夜培养冻胚的移植结局，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2009年1月～2011年12月在宁夏医科大学总医院生殖医学中心行FET助孕治疗的293对夫妇、337个移植周期资料。其中女方年龄19～35岁，不孕年限1～19年，BMI 18～25 kg/m2，子宫内膜厚度7～15 mm，每周期移植胚胎数1～3枚，原发不孕213周期，体外受精(IVF)方式受精183周期，自然周期内膜准备方案71周期。纳入标准：女方年龄≤35岁、18 kg/m2≤BMI≤25 kg/m2、采用长方案促排卵、IVF/卵胞质内单精子显微注射术(ICSI)周期数≤2、程序化慢速冷冻方法、胚胎均为受精后第3天冷冻、内膜准备方案为自然周期或激素替代。排除标准：女方年龄>35岁、BMI≥25 kg/m2或≤18 kg/m2、短方案或其他方式促排卵、IVF/ICSI周期数≥3、子宫内膜异位症或子宫畸形、促排卵方式准备内膜。将337个周期按移植前内膜准备方法的不同分为自然周期组(NC组)和激素替代周期组(HRT组)；再根据胚胎解冻后体外培养时间的不同分层(短时培养和过夜培养，短时培养指解冻后培养1～5 h移植;过夜培养指移植前1 d解冻后过夜培养，一般解冻距移植时间16～20 h)。本研究所用胚胎均为优质可移植胚胎。NC组、HRT组女方年龄分别为(29.4±3.3)、(29.2±3.7)岁，不孕年限分别为(4.24±3.01)、(4.38±3.13)年，内膜厚度分别为(10.28±1.20)、(10.05±1.44)mm，BMI分别为(21.18±2.00)、(21.65±2.16)kg/m2，IVF方式受精分别占49.30%、55.64%，原发不孕分别占61.97%、63.54%，输卵管因素导致不孕分别占77.46%、62.30%，男方因素导致不孕分别占18.31%、24.06%，排卵障碍导致不孕分别占4.23%、13.91%，内膜形态A型分别占2.82%、2.26%，内膜形态B型分别占76.06%、82.71%，内膜形态C型分别占21.13%、15.04%，两组输卵管因素导致不孕所占比例、排卵障碍导致不孕所占比例比较，P<0.05。

1.2 内膜准备及冻胚解冻、培养、移植方法 NC组采用自然周期准备方案。对月经规律、有排卵的患者，从月经周期第2、3天开始采用经引道B超监测卵泡，同时采集清晨空腹肘静脉血，监测血清基础促黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)及雌二醇(E2)水平；1周后监测优势卵泡及血清LH、FSH和E2值，其后每日监测B超，待优势卵泡发育至16 mm时检测血LH、E2，排卵后3 d或LH峰后4 d且内膜≥8 mm时开始肌注黄体酮60～80 mg行黄体支持。3 d后解冻胚胎，短时培养或过夜培养后移植。

HRT组采用激素替代周期准备方案。对排卵障碍或周期不规律及既往自然周期内膜<7 mm的患者，于月经周期或撤退性出血的第2、3天起开始口服戊酸雌二醇，采用递增方案，剂量在月经第2～5天为4 mg/d,第6～9天为6 mg/d。B超监测子宫内膜厚度，<8 mm时戊酸雌二醇加至8 mg/d口服维持，≥8 mm、E2>200 pg/mL时，开始肌注黄体酮60～80 mg/d行黄体支持。4 d后解冻胚胎，短时培养或过夜培养后移植，移植日开始肌注黄体酮60～80 mg/d支持。

1.3 FET结局观察方法 妊娠判断：胚胎移植后14 d测晨尿HCG阳性，血HCG>25 mIU/mL为生化妊娠，继续行黄体支持；移植后4周行B超检查，有孕囊及原始心管搏动为临床妊娠，继续黄体支持至孕12周。种植率(着床率)=孕囊数/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；多胎率=多胎妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%。

2 结果

2.1 NC组、HRT组FET结局比较 NC组、HRT组移植周期数分别为71、266，移植胚胎数分别为156、591，种植率分别为32.69%(51/156)、21.83%(129/591)，临床妊娠率分别为59.15%(42/71)、41.73%(111/266)，流产率分别为7.14%(3/42)、16.22%(18/111)，多胎率分别为21.43%(9/42)、13.51%(15/111)，NC组种植率和临床妊娠率高于HRT组(P均<0.05)。

2.2 NC组短时培养、过夜培养者FET结局比较 NC组短时培养、过夜培养女方年龄分别为(29.3±3.6)、(29.5±3.1)岁，不孕年限分别为(3.11±2.94)、(4.30±2.38)年，内膜厚度分别为(10.36±1.83)、(10.95±1.83)mm，BMI分别为(20.98±2.11)、(21.31±1.95)kg/m2，IVF方式受精分别占50.00%、47.73%，原发不孕分别占67.86%、58.14%，输卵管因素导致不孕分别占75.00%、79.07%，男方因素导致不孕分别占21.43%、16.28%，排卵障碍导致不孕分别占3.57%、4.65%，内膜形态A型分别占3.57%、6.98%，内膜形态B型分别占71.43%、74.42%，内膜形态C型分别占25.00%、18.60%，两者比较差异均无统计学意义。NC组短时培养、过夜培养者移植周期数分别为28、43，移植胚胎数分别为64、92，种植率分别为28.13%(18/64)、35.87%(33/92)，临床妊娠率分别为53.57%(15/28)、62.79%(27/43)，流产率分别为6.67%(1/15)、7.41%(2/27)，多胎率分别为20.00%(3/15)、22.22%(6/27)，上述指标两者比较差异均无统计学意义。

2.3 HRT组短时培养、过夜培养者FET结局比较 HRT组短时培养、过夜培养女方年龄分别为(29.5±3.6)、(28.9±3.7)岁，不孕年限分别为(4.62±3.32)、(4.15±2.94)年，内膜厚度分别为(10.11±1.01)、(10.10±1.21)mm，BMI分别为(21.11±1.55)、(21.02±1.75)kg/m2，IVF方式受精分别占58.14%、53.28%，原发不孕分别占65.89%、61.31%，输卵管因素导致不孕分别占61.24%、62.77%，男方因素导致不孕分别占24.81%、23.36%，排卵障碍导致不孕分别占13.95%、13.87%，内膜形态A型分别占1.56%、1.46%，内膜形态B型分别占83.72%、83.21%，内膜形态C型分别占14.73%、15.33%，两者比较差异均无统计学意义。HRT组短时培养、过夜培养者移植周期数分别为129、137，移植胚胎数分别为292、299，种植率分别为21.92%(64/292)、21.74%(65/299)，临床妊娠率分别为44.19%(57/129)、39.42%(54/137)，流产率分别为21.05%(12/57)、11.11%(6/54)，多胎率分别为12.28%(7/57)、14.81%(8/54)，上述指标两者比较差异均无统计学意义。

2.4 NC组、HRT组短时培养者FET结局比较 NC组、HRT组短时培养者一般情况、FET结局比较差异均无统计学意义。

2.5 NC组、HRT组过夜培养者FET结局比较 NC组过夜培养者子宫内膜厚度大于HRT组(P=0.001)。NC组过夜培养者种植率和临床妊娠率高于HRT组(P均<0.05)。其余指标NC组、HRT组过夜培养者相比差异均无统计学意义。

3 讨论

胚胎着床是人类生殖的关键步骤，良好的子宫内膜容受性是FET能否成功的关键因素[3]。多年来，为了提高FET成功率，临床医生摸索出了多种内膜准备方案，其中，自然周期和激素替代周期是最常用的两种方法。自然周期适用于平素月经规律、有自然排卵的患者，胚胎移植时机取决于监测到的LH峰(自发或HCG诱发)。激素替代周期用于既往月经不规律、无排卵且对促排卵无反应者，在该方案中，给患者应用外源性雌激素以模拟内源性雌激素促进子宫内膜增生的作用，抑制优势卵泡的发育，适时添加孕激素实现子宫内膜向分泌期的转化，综合判断移植时机。本研究结果显示：NC组输卵管因素导致不孕所占比例高于HRT组，而排卵障碍导致不孕所占比例低于HRT组，这符合两种内膜准备方法的适应证。目前，究竟哪种内膜准备方法能获得更好FET结局，仍存争议。

我们的研究发现自然周期方案的着床率及临床妊娠率均高于激素替代周期方案，这与Xiao等[4]、Levron等[5]的大样本回顾性临床研究结果相同。然而，Zheng等[6]则发现，相对于自然周期及半激素替代周期，激素替代方案可显著提高着床率及临床妊娠率，即使对于内膜≤8 mm者，激素替代周期仍能获得较好FET结局。魏思达等[7]也认为激素替代周期能获得满意种植率，影响FET临床妊娠率的因素包括女方年龄、FET日E2水平、移植胚胎的质量、移植胚胎的数目、移植胚胎的发育阶段(细胞期或囊胚期)。另有学者认为各种内膜准备方法对FET结局的影响无差异：Groenewoud等[8]的一项Meta分析指出，在冻融胚胎移植中，各种内膜准备方案对于临床妊娠率、继续妊娠率及活产率没有影响，对周期取消率的影响尚无定论。田莉等[9]也认为年龄是影响FET结局的关键因素，她们的研究结果显示：对于年龄≤35岁者可根据是否有排卵而采用自然周期或激素替代周期，对移植及妊娠结局均无影响；而对于年龄>35岁者，建议采用激素替代周期方案准备内膜，这可能会提高FET临床妊娠率。

解冻后移植时机是影响FET结局的另一可控因素。目前，FET选择胚胎的依据主要为两种形态学观察结果，一种是观察到解冻后胚胎卵裂球是否存活，这个过程只需短时培养(1～3 h)即可；另一种方法是胚胎解冻后经过夜培养，观察细胞期胚胎卵裂球是否分裂、囊胚是否扩张等，即胚胎是否复苏。目前，关于胚胎解冻后体外培养时间亦尚存争议。Rato等[10]认为与过夜培养相比，短时培养与高临床妊娠率和种植率相关；龚绍琼[11]的研究结果与之相似，而后者还认为流产率的增加与延长体外培养时间有关。本研究共收集过夜培养180周期，短时培养157周期，在相同的内膜准备方法内，体外培养时间对FET结局影响无差别，这与Guo等[12]的研究结果相似；乜照燕等[13]认为对于优质胚胎，体外培养时间不影响FET结局；秦祖兴等[14]研究结果显示，延长体外培养时间不能改善胚胎质量，但是可以合理安排次日实验室工作。本研究还发现，在相同培养时间内，两种内膜准备方法短时培养FET结局无差异，而过夜培养时，自然周期方案内膜厚度大于激素替代周期方案，着床率及临床妊娠率亦均高于后者。我国学者吴黎等[15]通过分析同济医院498个FET周期发现，延长冻融胚胎体外培养时间可以更好地根据胚胎发育潜能挑选优质胚胎移植,提高妊娠率,改善妊娠结局。柴三明等[16]也认为延长体外培养时间可以使胚胎与子宫内膜发育同步，还可使冷冻保护剂充分代谢，减少其对胚胎后续发育的影响，显著提高胚胎发育潜能及临床妊娠率。然而，上述所有研究均未涉及FET前子宫内膜准备方案，所以，相对而言，我们的研究结果更可信，更具临床实用价值。

本研究的不足之处在于为回顾性研究，研究对象不能进行随机分组，另外样本量较小，但为了减少偏倚，本研究设有严格纳入标准，使两组对象具有可比性，确保结果的可靠性。

总之，自然周期方法准备内膜可获得较好的FET结局，其子宫内膜增生及转化所需的激素来源是卵泡发育产生的内源性性激素，符合生理要求，对内膜微环境的干扰小；而激素替代周期中子宫内膜生长及转化完全依赖于外源性激素，其微观环境受到一定程度损坏，影响了子宫内膜容受性。在临床实际工作中，应综合评估患者各方面情况，遵循个体化原则，对于有条件的患者，建议其首先考虑自然周期方法准备内膜。

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Observation on outcome of frozen-thawed embryo transfer between short-time and long-time culture to infertile patients whose endometria were prepared with natural or hormone replacement cycle protocol

FANXiaoling1,WANGLei,ZHANGYafeng,HURong

(1CaihongHospital,Xianyang712000,China)

Objective To observe the outcome of frozen-thawed embryo transfer (FET) between the short-time and long-time culture embryos of the infertile patients whose endometria were prepared with natural or hormone replacement cycle protocol.Methods A total of 293 patients and 337 FET cycles were enrolled, and all cycles were divided into two groups depending on their means of preparing the endometria: natural cycle (NC) protocol (NC group) and hormone replacement cycle (HRT) protocol (HRT group), each group was divided into two layers according to the culture time of thawed embryos in vitro: short-term and overnight layers. The outcomes of clinical pregnancy rate (CPR), implantation rate (IR), spontaneous abortion rate (SAR) and multiple pregnancy rate (MPR) per cycle were compared.Results In the NC and HRT groups, the IR was respectively 32.69% and 21.83%, the CPR was 59.15% and 41.73% , the SAR was 7.14% and 16.22%, the MPR was 21.43% and 13.51%, respectively, and the IR and CPR were all higher in the NC group than those of the HRT group (allP<0.05). In the short-term and overnight layers of the NC group, the IR was 28.13% and 35.87%, the CRP was 53.57% and 62.79%, the SAR was 6.67% and 7.41%, and the MPR was 20.00% and 22.22%, respectively; no significant differences were found between the two groups. Similarly, in the HRT group's different culture time layers, the IR was 21.92% and 21.74%, the CRP was 44.19% and 39.42%, the SAR was 21.05% and 11.11%, and the MPR was 12.28% and 14.81%, respectively; no statistically significant difference was found. In short-term layer, the outcomes of FET were not statistically different between the NC group and HRT group. Compared with the overnight layer of HRT group, IR and CPR were all higher than in the overnight layer of NC group (allP<0.05).Conclusion Endometrium prepared with NC protocol can obtain a better FET outcome than that of the HRT protocol, which mainly embodied in the selection of the thawed embryos'culture time in vitro before transplant, and culture overnight is appropriate.

embryo transfer; natural cycle; endometrial preparation; hormone replacement cycle

国家自然科学基金资助项目(81260109)；宁夏医科大学总医院特殊人才启动项目(XT201421)；宁夏医科大学重点实验室

范晓玲(1975-),女，主治医师，主要从事妇科生殖内分泌的研究。E-mail: fanxl19750108@163.com

简介：胡蓉(1974-)，女，主任医师，硕士研究生导师，主要从事妇科生殖内分泌的研究。E-mail: hr7424@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.002

713.7

A

1002-266X(2016)35-0005-04

2016-05-30)

项目(XY201404);宁夏自治区科技攻关项目(KF2010-49)。