阿司匹林抵抗的动脉粥样硬化缺血性脑卒中患者COX-2基因启动子区-765G/C多态性观察

陈建昌，孙其中，郝跃伟

(1山东大学附属省立医院，济南250022；2山东省医学影像学研究所)



阿司匹林抵抗的动脉粥样硬化缺血性脑卒中患者COX-2基因启动子区-765G/C多态性观察

陈建昌1，孙其中2，郝跃伟1

(1山东大学附属省立医院，济南250022；2山东省医学影像学研究所)

目的 观察阿司匹林抵抗(AR)的动脉粥样硬化缺血性脑卒中患者环氧化酶2(COX-2)基因启动子区-765G/C的多态性，探讨COX-2基因启动子区-765G/C的多态性与AR发生的关系。方法 服用阿司匹林治疗的动脉粥样硬化缺血性脑卒中患者313例，其中AR 26例(AR组)、阿司匹林半抵抗(ASR)54例(ASR组)、阿司匹林敏感(AS)233例(AS组)。采用real-time PCR法观察三组COX-2基因启动子区-765G/C多态性。结果 AR组COX-2基因启动子区-765位点GG基因型频率为46.2%、GC为38.5%、CC为15.4%；ASR组GG基因型频率为48.1%、GC为42.6%、CC为9.3%；AS组GG基因型频率为76.0%、GC为21.5%、CC为2.6%；AR组G等位基因频率为65.4%、C等位基因频率为34.6%，ASR组G等位基因频率69.4%、C等位基因频率30.6%，AS组G等位基因频率86.7%、C等位基因频率13.3%。AR组、ASR组COX-2基因启动子区-765位点GC、CC基因型频率和C等位基因频率均高于AS组(P均<0.01)。结论 存在AR和ASR的动脉粥样硬化缺血性脑卒中患者COX-2基因启动子区-765位点GC、CC基因型和C等位基因频率高于AS患者；COX-2基因启动子区-765G>C可能与AR的发生有关。

环氧化酶2；基因多态性；单核苷酸多态性；阿司匹林；缺血性脑卒中；动脉粥样硬化

阿司匹林可有效抑制血小板活化及聚集，防止血栓形成，是脑血管病一级和二级防治的常用药物[1]。然而部分患者常规剂量甚至高剂量服用阿司匹林不能有效抑制血小板聚集，仍有一定的血管不良事件发生率，因此有学者[2～5]提出了“阿司匹林抵抗(AR)”的概念，AR的患者不能在阿司匹林防治心血管病中获益。AR发生的原因及机制不甚清楚，推测可能的内源性因素有环氧化酶2(COX-2)基因多态性等[6,7]。COX-2可以诱导花生四烯酸转化成前列腺素E2，进而转化成血栓素A2。阿司匹林可以抑制上述过程。COX-2基因的-765G/C位点位于启动子区域，突变可影响启动子活性而改变COX-2的表达，此位点突变是否与AR的发生有关目前鲜有报道。为此，本研究观察了AR动脉粥样硬化缺血性脑卒中患者COX-2基因启动子区-765G/C的多态性，探讨COX-2基因启动子区-765G/C的多态性与AR发生的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2013年4月～2015年8月在山东省立医院西院住院治疗的动脉粥样硬化缺血性脑卒中患者313例，男192例、女121例，年龄(67±11)岁。患者均按医嘱规范服用阿司匹林100 mg/d超过20 d。AR或阿司匹林半抵抗(ASR)判定标准[3]：取空腹静脉血3 mL，采用全血电阻法，应用配套的二磷酸腺苷(ADP)和胶原(COL)为诱导剂，测定血小板聚集率，即电阻抗值，同时满足ADP诱导的电阻抗值>13 Ω、COL诱导的电阻抗值≥18 Ω两个条件者判定为AR，满足其一者为ASR，均不满足者为阿司匹林敏感(AS)。排除近4周使用其他抗血小板、抗凝和非甾体抗炎药物者。313例中，AR 26例(AR组)，ASR 54例(ASR组)，AS 233例(AS组)。三组在年龄、性别构成、BMI、合并糖尿病和高脂血症方面差异无统计学意义。AR组、ASR组合并原发高血压比例高于AS组(P均<0.01)。详见表1。

1.2 COX-2基因启动子区-765G/C多态性观察 采用real-time PCR法。采集三组空腹外周静脉血2 mL，存储于EDTA抗凝管中，抽提基因组DNA。PCR引物序列参照文献[8,9]设计。引物由上海生工生物技术有限公司合成，等位基因特异引物AS1序列为5′-GCGGGCTCCTTGTTTCTTGGAAAGAGATGG-3′，AS2序列为5′-GCGGGCAGGGCGGCTCCTTGTT-TCTTGGAAAGAGATGC-3′，共同引物CP序列为5′-AGGGTAACTGCTTAGGACCAGTATTATGAGGAG-3′。PCR反应体系为15 μL，包括基因组DNA为1 μL，三种引物每种0.2 μmol/L，AmpliTaq DNA Polymerase 1.8 U，Tris-HCl 10 mmol/L，氯化钾40 mmol/L(pH 8.0)，氯化镁2 mmol/L，dATP、dCTP、dGTP各50 μmol/L，dTTP 25μmol/L，dUTP 75 μmol/L，0.2× SYBR Green Ⅰ、5%二甲基亚砜(DMSO)、2.5%甘油、ROX 染料0.25 μmol/L，不足15 μL的部分由双蒸水(dH2O)补足。PCR反应条件：95 ℃ 12 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环，分析熔解曲线。

表1 三组一般资料比较

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验；用LDA软件进行连锁不平衡状态分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

COX-2基因-765G/C的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),具有群体代表性。AR组COX-2基因启动子区-765位点GG基因型频率为46.2%、GC为38.5%、CC为15.4%,ASR组GG基因型频率为48.1%、GC为42.6%、CC为9.3%,AS组GG基因型频率为76.0%、GC为21.5%、CC为2.6%,AR组G等位基因频率为65.4%、C等位基因频率为34.6%，ASR组G等位基因频率69.4%、C等位基因频率30.6%，AS组G等位基因频率86.7%、C等位基因频率13.3%。AR组、ASR组COX-2基因启动子区-765位点GC、CC基因型频率和C等位基因频率高于AS组(P均<0.01)。

3 讨论

阿司匹林是动脉粥样硬化缺血性脑卒中防治中最常用的药物[10]，目前AR的发生率为8%～45%[11,12]，可能与药物剂量及基因多态性等[6,7]有关。COX是前列腺素合成的重要限速酶，分为COX-1和COX-2。COX-1表达于所有组织细胞，参与机体正常的生理功能；COX-2在生理状态下较少表达，但在多种病理因素(如炎症介质、激素、细胞因子等)诱导下可高表达。COX-2的产物前列腺素在炎症及粥样硬化斑块破裂中发挥重要作用[13～16]。常规剂量阿司匹林对COX-2的抑制作用微弱，可能导致AR的发生。研究[17]表明，COX-2基因启动子区-765G/C突变可改变启动子活性而影响基因表达，可能成为个体发生AR的一个因素。

本研究结果显示，AR组、ASR组COX-2基因启动子区-765位点GC、CC基因型及C等位基因频率均高于AS组，与国内外一些报道结论相同，提示C等位基因携带者有较高几率发生AR，从而增加脑血管事件的发生率。杨蓉等[18]研究发现AS组与AR组等位基因C频率有差异，推断等位基因C可促进COX-2的表达，使得血栓素A2生成增加、血小板激活，影响阿司匹林的抗血小板功能，导致AR的发生。也有一些学者[19]得出了相反结论，但该研究纳入样本量较少，可能对结果有一定影响。Takahashi等[20]研究结果显示冠心病患者发生AR与COX-2基因启动子区-765G>C并无显著关系，推测可能存在其他的分子生物学机制。出现这种差异，可能是由于各独立研究者选取的人群、种族不同以及样本量的较大差异导致的。

综上可见，COX-2基因启动子区-765G>C可能与AR的发生有关，但未来仍需要进行多中心、更大样本量的研究以及进一步功能试验来验证上述结论。

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