RNAi沉默Rac1基因对结肠癌细胞增殖及裸鼠成瘤的影响

解娜，黄幼生，罗志飞，薛逢贵

(1 海南医学院附属医院，海口571101；2 海南医学院)



·论著·

RNAi沉默Rac1基因对结肠癌细胞增殖及裸鼠成瘤的影响

解娜1,2，黄幼生1,2，罗志飞1,2，薛逢贵1

(1 海南医学院附属医院，海口571101；2 海南医学院)

目的 探讨RNAi沉默Rac1基因对结肠癌细胞增殖及裸鼠成瘤的影响。方法 ①细胞实验：体外培养结肠癌细胞SW480，随机分为空白对照组、阴性对照组、shRNA-Rac1组，阴性对照组、shRNA-Rac1组分别转染空载质粒慢病毒、shRNA-Rac1慢病毒。采用RT-PCR技术、Western blotting法检测各组Rac1 mRNA及其蛋白表达；采用MTT法检测各组转染24、48、72、96 h的细胞增殖情况。②动物实验：取shRNA-Rac1组、阴性对照组转染后细胞分别接种于裸鼠皮下，建立结肠癌裸鼠移植瘤模型(分别记为观察组、对照组)，观察裸鼠成瘤及移植瘤生长情况，喂养35天脱臼处死，完整剥离肿瘤组织，称取瘤体质量并测量肿瘤体积。同时检测瘤体Rac1蛋白表达情况。结果 ①细胞实验：与阴性对照组比较，shRNA-Rac1组Rac1 mRNA及其蛋白表达明显降低(P均<0.05)；与阴性对照组比较，shRNA-Rac1组各时间点细胞增殖速度明显降低(P均<0.05)。②动物实验：对照组癌细胞接种4～8天均可见瘤体形成，观察组接种35天仅2只成瘤，且瘤体形成时间较对照组晚10天。接种35天，观察组、对照组瘤体体积分别为(32.54±43.13)、(948.13±523.50)mm3，瘤体质量分别为(0.023±0.031)、(0.873±0.372)g，两组比较P均<0.01。与对照组比较，观察组瘤体组织Rac1蛋白阳性表达率明显降低(P<0.05)。结论 抑制Rac1表达能降低结肠癌细胞增殖速度，抑制裸鼠移植瘤生长。

结肠癌；Rac1；RNA干扰；裸鼠成瘤；细胞增殖

结肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一，在我国其病死率居所有恶性肿瘤的第五位，复发和转移是患者死亡的主要原因[1，2]。Rac1是Rac亚家族的一个重要成员，是细胞内重要的信号转导分子。近年研究发现，Rac1在人类大部分侵袭性肿瘤中高表达，如胃癌、乳腺癌、肺癌等[3～8]，并与肿瘤的侵袭和转移可能有关[4,9]。本课题组前期研究发现，抑癌剂二烯丙基二硫(DADS)处理结肠癌细胞HT-29后，Rac1 mRNA转录水平下调[10,11]，但在动物实验中未发现Rac1表达与结肠癌细胞增殖有关。2014年6月～2015年2月，本研究应用RNAi技术沉默Rac1基因，观察Rac1基因沉默对人结肠癌细胞增殖及裸鼠成瘤的影响，旨在探究结肠癌发生、发展的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人结肠癌细胞株SW480购自中国科学院上海细胞研究所；GV148-Rac1-shRNA慢病毒质粒连接及慢病毒包装由上海吉凯基因化学技术有限公司完成，shRNA-Rac1干扰序列为5′-CCTTCTTAACATCACTGTCTT-3′。雌性BALB/c裸鼠20只，5周龄，体质量(20±2)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。DMEM、FBS购自美国Gibco公司。TRIzol购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒FastQuant RT Kit (With gDNase)、荧光定量PCR试剂盒Quant qRT-PCR kit(SYBR Green)购自北京天根生化科技有限公司。Rac1、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；RIPA蛋白裂解液、ECL Plus、PMSF及BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。兔抗人Rac1、GAPDH单克隆抗体、羊抗兔二抗购自美国Abcam公司；SPV-9000通用型二步法免疫组化检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 细胞实验

1.2.1 慢病毒转染 37 ℃、50 mL/L CO2饱和湿度培养箱中培养结肠癌细胞SW480，培养基为含双抗及10%小牛血清的DMEM，待细胞融合度达80%且处于对数生长期时胰酶消化、吹打，制成2.5×104个/mL的细胞悬液并接种于6孔板，每孔2 mL。随机将细胞分为shRNA-Rac1组、阴性对照组及空白对照组。待细胞处于对数生长期、融合度达30%时，shRNA-Rac1组、阴性对照组分别转染shRNA-Rac1慢病毒、空载质粒慢病毒。在1 mL无血清及抗菌药物的培养基中加入2×106TU目标或阴性控制病毒、5 ng Polybrene，混匀后分别转染shRNA-Rac1组及阴性对照组，2～3天于倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况。转染48 h，每孔加入1 μg/mL的嘌呤霉素筛选稳定转染细胞，继续培养48 h，更换常规培养基培养。当细胞处于对数生长期且融合度达80%时收集细胞，进行下一步干扰抑制效率检测及裸鼠成瘤实验。

1.2.2 Rac1 mRNA干扰效率检测 采用RT-PCR技术。按TRIzol试剂盒说明提取各组细胞总RNA[12]，琼脂糖凝胶电泳及分光光度计分别检测RNA纯度及浓度。取各组细胞总RNA 0.5 μg，按FastQuant RT Kit说明书进行逆转录。Rac1及内参GAPDH引物由Primerprimer6.0软件进行设计。Rac1上游引物5′-ATGTCCGTGCAAAGTGGTATC-3′，下游引物5′-CTCGGATCGCTTCGTCAAACA-3′；GAPDH上游引物5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′，下游引物5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。根据Quant qRT-PCR kit (SYBR Green)说明书设置反应体系及反应条件，反应体系共20 μL：SYBR 10 μL，上下游引物各0.4 U、cDNA 2 μL、ddH2O 7.2 μL。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。每组设计3个重复孔，采用2-ΔΔCt法计算Rac1 mRNA相对表达量。ΔCt=目的基因Ct平均值-内参照Ct平均值，ΔΔCt=ΔCtshRNA-Rac1组-ΔCt阴性对照组。所有反应程序、参数及Ct值均由ABI AVIIL荧光定量PCR仪完成。

1.2.3 Rac1蛋白抑制效率检测 采用Western blotting法。RIPA(含1 mmol/L)提取各组细胞总蛋白，BCA法定量后，加上样缓冲液100 ℃变性，-20 ℃保存。蛋白变性后每孔上样30 μg，经12% SDS-PAGE胶电泳，100 mA电流条件下60 min转至PVDF膜，5%脱脂牛奶常温封闭2 h，Rac1(1∶200)和GAPDH(1∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜；次日TBST洗膜3遍，加入羊抗兔二抗(1∶5 000)常温孵育1.5 h，TBST洗涤3遍，ECL底物显色，获取图像，并对条带灰度值进行分析。

1.2.4 细胞增殖情况观察 采用MTT法。具体操作按文献[11]进行。将各组结肠癌细胞接种于96孔板，每组设3个复孔，每孔初始接种细胞2×103个，置37 ℃、50 mL/L CO2恒温箱中孵育。分别于贴壁后24、48、72、96 h加入200 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h，去上清液，每孔加入100 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡15 min，使结晶物充分溶解。用Tecan Infinite M1000 PRO多功能酶标仪于480 nm处检测各孔的光密度(OD)值。以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞增殖曲线。

1.3 动物实验

1.3.1 裸鼠移植瘤模型构建 将20只裸鼠随机分为观察组、对照组，每组10只。待shRNA-Rac1组及阴性对照组细胞融合达80%且处于对数生长期时，胰酶消化、吹打，1 500 r/min离心3 min，移除上清液，PBS清洗2遍，生理盐水重悬细胞，台盼蓝计数后稀释成2×107个/mL的细胞悬液，分别接种于两组裸鼠右腋下0.5 cm处，每只裸鼠接种0.2 mL。接种后的裸鼠在SPF级动物房中饲养，每隔1天观察并记录瘤体大小，包括瘤体长短径，称量裸鼠体质量，建立生长曲线。喂养35天脱臼处死，完整剥离肿瘤组织，称取瘤体质量并测量肿瘤体积。

1.3.2 裸鼠瘤体Rac1表达检测 各组瘤体于10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。切片经二甲苯脱蜡、逐步水化、30% H2O2封闭，枸橼酸(pH 6.0)高压修复10 min，一抗37 ℃ 1 h，PBS洗涤3遍，二抗37 ℃孵育20 min，DAB显色至阳性对照片清晰着色，苏木素衬染1 min。结果判定参照文献[13]：阳性染色定位于细胞质，呈棕褐色颗粒状；以细胞质无着色为-，微弱着色为+，中等强度着色为++，棕黄色为+++；以-、+为低表达，++、+++为高表达。连续计数3个高倍镜视野(×400)，每个视野连续计数200个癌细胞，观察Rac1蛋白阳性表达情况。

2 结果

2.1 细胞实验结果

2.1.1 RNAi沉默Rac1基因表达效率 转染48 h，倒置荧光显微镜下可见，shRNA-Rac1组及阴性对照组90%以上细胞表面出现绿色荧光。空白对照组Rac1 mRNA及其蛋白的相对表达量分别为1.13±0.13、0.92±0.05，阴性对照组分别为1.01±0.12、0.84±0.04，shRNA-Rac1组分别为0.33±0.01、0.29±0.06。与阴性对照组比较，shRNA-Rac1组Rac1 mRNA及其蛋白表达明显受到抑制(P均<0.05)，其mRNA抑制率达67.3%，蛋白抑制率为65.5%，可进行下一步实验。

2.1.2 Rac1基因表达沉默对SW480细胞增殖的影响 验证LV-shRNA-Rac1具有显著抑制Rac1表达效率后，应用MTT法检测转染不同时间SW480细胞增殖情况。结果见表1。

表1 各组转染不同时间SW480细胞增殖比较±s)

注：与空白对照组、阴性对照组比较，*P<0.05。

2.2 动物实验结果

2.2.1 裸鼠移植瘤生长情况 对照组接种第4～8天肉眼均可见瘤体形成，而观察组接种35天内仅2只裸鼠成瘤，且瘤体形成时间较对照组晚10天。瘤体表现为接种部位出现皮下小结节，初始为椭圆形，逐渐长大，最终呈现不规则、凹凸分叶状。接种5周后，观察组、对照组瘤体体积分别为(32.54±43.13)、(948.13±523.50)mm3，瘤体质量分别为(0.023±0.031)、(0.873±0.372)g，两组比较P均<0.01。

2.2.2 两组瘤体组织Rac1蛋白阳性表达比较 见插页Ⅰ图1。观察组瘤体组织Rac1蛋白阳性表达率为12.1%，对照组为90.2%，两组比较P<0.05。

3 讨论

肿瘤血管生成是恶性肿瘤发生转移的重要机制之一，血管生成的基础过程涉及细胞移动、基因表达活性改变及复杂的信号网络调节。Rac1是GTPases Rho家族的重要成员之一，基因全长29 kb，包含7个外显子，位于人染色体7p22。Rac1基因的转录产物有1.2、2.5 kb两种，是细胞内重要的信号转导分子。Rac1过表达能促进肿瘤细胞血管生成及迁移能力，从而促进肿瘤细胞的侵袭、转移[3,4]。目前对Rac1调节肿瘤转移的机制尚不完全清楚，可能与以下机制有关：①刺激新的肌动蛋白聚合，通过活化靶蛋白Scar/Wave激活Arp2/3复合体，该复合体是一种肌动蛋白相关蛋白，能刺激肌动蛋白单体的成核作用，从而导致新的肌动蛋白丝形成，加快细胞移动[3,13]。②通过调节CDC42、干扰素、VEGF等因子的表达促进肿瘤血管的形成，继而导致肿瘤细胞转移[3]；③通过下游分子Pak1激活Limk1，调节Cofilin活动。Rac1和Cdc42可间接活化Limk1，上调尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(uPA)，增强uPA启动子活性，诱导uPA和uPA受体表达及uPA的分泌，降解细胞外基质，促进癌细胞的侵袭和转移[14,15]。④Rac1能抑制TGF-β诱导的p38 MAPK磷酸化，通过NOXs-ROS通路激活NF-κB，调节uPA和基质金属蛋白酶9，活化核转录因子Snail诱导上皮间质转化，促肿瘤侵袭的转移[3,16]。

有研究报道，结肠癌细胞中Rac1阳性表达明显升高，并与结肠癌的浸润和转移有一定相关性。其促进结肠癌浸润和转移的机制可能与CDC42、smad4、ERK/JNK等信号的激活，继而促进上皮间质转化有关[17,18]。本课题组前期研究发现，抗癌剂DADS能抑制结肠癌细胞Rac1的表达，可能涉及细胞周期及凋亡调控[11,12]。但沉默Rac1表达对结肠癌细胞增殖及肿瘤形成能力的影响目前尚不清楚。

有研究显示，Rac1抑制剂NSC23766、EHT 1864等处理肿瘤细胞后，肿瘤细胞增殖速度降低[3,4]。本研究结果显示，慢病毒介导shRNA-Rac1转染结肠癌细胞后，能抑制Rac1基因mRNA及其蛋白表达，且其细胞增殖速度明显降低，与以往研究[3,4,11,18]结果基本一致。表明Rac1过表达可能参与结肠癌细胞恶性演进的生物学过程。本研究还发现，对照组均于接种第4～8天出现肉眼可见的瘤体，而观察组仅2只于接种2周后有瘤体形成；观察组移植瘤生长速度、肿瘤体积和质量均明显低于对照组，移植瘤组织中Rac1 mRNA及其蛋白表达均低于对照组，与其在细胞水平上的表达一致。证实在裸鼠瘤体内shRNA-Rac1对Rac1 mRNA及其蛋白表达均有抑制作用。提示沉默Rac1基因表达能抑制结肠癌细胞增殖，遏制结肠癌细胞裸鼠移植瘤形成。

综上所述，以慢病毒介导的Rac1基因沉默能抑制结肠癌细胞增殖及裸鼠移植瘤的生长；Rac1表达变化可能与结肠癌的发生、发展有关，有可能作为结肠癌潜在的治疗靶点。

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Effects of RNAi-mediated knockdown of Rac1 gene on growth and transplanted tumors of colon cancer SW480 cells in nude mice

XIENa1,HUANGYousheng,LUOZhifei,XUEFenggui

(1TheAffiliatedHospitalofHainanMedicalUniversity,Haikou571101,China)

Objective To investigate the effects of Rac1 gene silenced by RNA interference (RNAi) on cell proliferation and growth of subcutaneous tumor of colon cancer SW480 cells in nude mice. Methods ① Cell experiment: colon cancer SW480 cells cultured in vitro were randomly divided into the blank control group, negative control group, and shRNA-Rac1 group. Recombinant lentivirus virus vector (NC-shRNA and Rac1-shRNA) were constructed and were respectively transfected into negative control group and shRNA-Rac1 group. The expression levels of Rac1 mRNA and protein were measured by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), and Western blotting, respectively. Cell proliferation at 24, 48, 72, and 96 h after transfection was determined by MTT. ② Animal experiment: cells from shRNA-Rac1 group and negative control group were planted into nude mice to establish mice models of colon cancer (observation group and control group). Formulation and growth of the tumor was observed. After the mice were sacrificed by cervical dislocation, tumor tissues were removed completely and we measured its weight and size. Meanwhile, Rac1expression was also detected by immunohistocytochemistry. Results ① cell experiment: Compared with the blank control group and negative control group, the expression of Rac1 mRNA and protein in the shRNA-Rac1 group decreased significantly (allP<0.05). The proliferation ability of colon cancer cells was significantly inhibited in the shRNA-Rac1 group at all detecting time points as compared with that of the control group (allP<0.05). ② Animal experiment: tumor was observed in all cases of the control group 4-8 days after the transplantation. While in the observation group, tumor was only observed in 2 cases 35 days after the transplantation, and it took 10 days longer to form a tumor than that in the control group. On the 35th day of transplantation, average volume of the tumor in the observation group and control group was (948.13±523.50) and (32.54±43.13) mm3, and the tumor average weight was respectively (0.873±0.372) and (0.023±0.031) g, and significant difference was found between the two groups (allP<0.01). Besides, compared with the control group, the expression rate of Rac1 in the observation group was significantly lower than that in the control group (P<0.01). Conclusion Silencing the expression of Rac1 decreases the proliferation of colon cancer cells SW480 and inhibits the tumor formation in nude mice.

colon cancer; Rac1; RNA interference; tumor growth in nude mice; cell proliferation

国家自然科学基金资助项目(81260321)。

解娜(1979-)，女，讲师，研究方向为肿瘤病因及发病机制。E-mail： xiena2005@163.com

简介：黄幼生(1976-)，男，副教授，研究方向为消化系统恶性肿瘤浸润转移机制。E-mail： hys768811@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.001

R735.3

A

1002-266X(2016)40-0001-04

2016-01-22)