外周血循环肿瘤细胞EGFR表达对晚期非小细胞肺癌患者TKI治疗效果及预后的影响

江波，金从国，涂长玲，何文杰，杨承纲，李高峰

(云南省肿瘤医院 昆明医科大学第三附属医院，昆明650118)



外周血循环肿瘤细胞EGFR表达对晚期非小细胞肺癌患者TKI治疗效果及预后的影响

江波，金从国，涂长玲，何文杰，杨承纲，李高峰

(云南省肿瘤医院 昆明医科大学第三附属医院，昆明650118)

目的 探讨外周血循环肿瘤细胞(CTC)表皮生长因子受体(EGFR)表达对晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗效果及预后的影响。方法 选择晚期NSCLC患者66例，从三种TKI类药物(吉非替尼、厄洛替尼、盐酸埃可替尼)中任选一种治疗1个月。治疗前随机选取10例患者采集空腹静脉血，采用流式细胞分选技术分选外周血CTC并验证。采用流式细胞术检测所有患者治疗前及治疗1个月外周血CTC EGFR表达，比较EGFR高表达者和低表达者的治疗效果(有效率及控制率)及生存情况。结果 经流式细胞术分选的CD45-CK18+细胞光镜下可见，其细胞核染色加深，染色质变粗，核质比增大，具备恶性肿瘤细胞特征，证实CD45-CK18+细胞为外周血CTC。66例晚期NSCLC患者中，EGFR高表达者30例、低表达者36例。EGFR高表达者和低表达者TKI治疗有效率分别为53.3%(16/30)、27.8%(10/36)，控制率分别为80.0%(24/30)、44.4%(16/36)，两者比较P均<0.05。EGFR高表达者和低表达者中位无进展生存期分别为11、4个月，中位总生存期分别为21、10个月，1年生存率分别为77.8%、63.3%，2年生存率分别为38.1%、31.2%，3年生存率分别为22.2%、3.3%，两者比较P均<0.05。结论 外周血CTC中EGFR高表达的晚期NSCLC患者TKI靶向治疗效果及预后均优于EGFR低表达者。

非小细胞肺癌；循环肿瘤细胞；表皮生长因子受体；酪氨酸激酶抑制剂

有研究显示，无论是在肿瘤原发病灶切除前还是切除后，患者体内都可检测到循环肿瘤细胞(CTC)[1～3]。CTC存在表皮生长因子受体(EGFR)信号传导通路异常，如EGFR过度表达、EGFR突变等，可促进肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡，导致生长调节失控[4]。近年来，分子靶向治疗逐渐得到推广，EGFR是目前研究最多的肺癌治疗靶点。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的常用靶向治疗药物。本研究探讨外周血CTC中EGFR表达对晚期NSCLC患者TKI治疗效果及预后的影响。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年5月～2014年5月云南省肿瘤医院收治的晚期NSCLC患者66例，男40例、女26例，年龄41～78岁；均经组织病理检查明确诊断；病理类型：腺癌58例，鳞癌8例；TNM分期：Ⅲb期4例，Ⅳ期62例；功能状态(PS)评分：0～1分44例，≥2分22例。纳入标准：①组织病理检查明确为NSCLC；②影像学检查(CT或MRI)有可测量的病灶；③入组前未接受过TKI类药物治疗；④预计生存期>3个月；⑤无TKI治疗禁忌证。排除标准：①组织病理检查无法确诊为NSCLC；②既往已进行TKI类药物治疗。

1.2 治疗方法 30例患者口服吉非替尼250 mg，1次/d；10例患者口服厄洛替尼150 mg，1次/d；26例患者口服盐酸埃可替尼125 mg，3次/d。疗程均1个月。

1.3 外周血CTC分选及验证 采用流式细胞分选技术。治疗前随机选取10例患者采集空腹静脉血20 mL，肝素抗凝，将其分成20管，每管1 mL。每管均加入CD45-PC5、CK18-FITC各200 μL，避光保存30 min；加入氯化铵(NH4Cl)溶血素4 mL，反复溶血直到液体透亮，离心后加入培养液，流式细胞仪进行分选。设置SORT的左右收集细胞群，一般左侧为CD45-CK18+细胞，右侧为非CD45-CK18+细胞。根据要求设置收集数目为1 000个，同时在样本收集处安装分选试管，开始收集细胞。流速为10 000～25 000个/s，收集过程中需全程振荡。将分选的CD45-CK18+细胞用玻片收集微球后，进行HE染色，光镜下观察细胞特征。

1.4 外周血CTC EGFR表达检测 采用流式细胞术。66例患者于TKI类药物治疗前及治疗1个月采集肘正中静脉血5 mL。取5 mL无菌试管，加入 CD45-PC5、EGFR-PE和CK18-FITC各20 μL，然后加入肝素抗凝的外周静脉血100 μL摇匀，避光室温保存30 min。加入NH4Cl溶血素2 mL溶血，15 min后上流式细胞仪检测，记录外周血CTC EGFR表达。以外周血CTC EGFR表达的中位数作为界值，大于中位数定义为EGFR高表达，小于中位数定义为EGFR低表达。

1.5 疗效评价及随访 ①疗效评价：治疗1个月后参照WHO实体瘤疗效评价标准[5]评价疗效，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)、疾病进展(PD)，以CR+PR计算有效率，以CR+PR+SD计算控制率。②预后情况：治疗后随访3年，记录患者的无进展生存期(PFS)、总生存期(OS)和1、2、3年生存率。PFS指治疗首日至病情进展的时间，OS指治疗首日至死亡日或失访日。比较EGFR高表达者和低表达者的有效率、控制率，中位PFS、中位OS和1、2、3年生存率。

2 结果

2.1 外周血CTC验证 光镜下可见，CD45-CK18+细胞核染色加深，染色质变粗，核质比增大，具备恶性肿瘤细胞特征，证实CD45-CK18+细胞为外周血CTC。见插页Ⅲ图10。

2.2 EGFR高表达者和低表达者疗效比较 66例晚期NSCLC患者中，EGFR高表达者30例、低表达者36例。30例EGFR高表达者CR 2例、PR 14例、SD 8例、PD 6例，有效率为53.3%(16/30)，控制率为80.0%(24/30)；36例EGFR低表达者CR 0例、PR 10例、SD 6例、PD 20例，有效率为27.8%(10/36)，控制率为44.4%(16/36)；EGFR高表达者有效率及控制率均高于EGFR低表达者(P均<0.05)。

2.3 EGFR高表达者和低表达者预后比较 EGFR高表达者和低表达者中位PFS分别为11、4个月，中位OS分别为21、10个月，1年生存率分别为77.8%、63.3%，2年生存率分别为38.1%、31.2%，3年生存率分别为22.2%、3.3%。EGFR高表达者中位PFS、中位OS和1、2、3年生存率均高于EGFR低表达者(P均<0.05)。见图1、2。

图1 EGFR高表达和低表达者PFS比较

图2 EGFR高表达和低表达者OS比较

3 讨论

EGFR是NSCLC治疗的一个重要靶点，针对该靶点的治疗药物已在临床上广泛应用，是目前临床靶向治疗用药的一个研究热点。临床研究证实，TKI类药物治疗EGFR突变型NSCLC患者的有效率为65%～83%，而对野生型患者的有效率为10%～15%[6]。因此，NCCN指南已把EGFR基因突变阳性作为应用TKI类药物的先决条件。目前在中国获批用于临床的TKI类药物有吉非替尼、厄洛替尼及盐酸埃克替尼。在分子结构上，三种药物均含有喹唑啉母环的基本结构，其中厄洛替尼与盐酸埃克替尼的差别仅在侧链的开环与闭环；在药代动力学上，吉非替尼与厄洛替尼的半衰期较盐酸埃克替尼更长，因此服药时间有所差异(吉非替尼和厄洛替尼为每天1片，盐酸埃克替尼为每天3片)；在疗效上，三种药物的客观缓解率、PFS及疗效均无明显统计学差异[7～14]。因此，本研究对治疗药物的选择未进行强行规定，任意一种TKI类药物治疗的晚期NSCLC患者即可纳入研究。

临床上检测EGFR突变的方法有很多，但每种检测方法均依赖于组织标本[7]。目前多数NSCLC患者EGFR基因突变检测均以手术切除的肺癌组织作为检测标本，此时患者多处于早期而未进行靶向治疗，而晚期患者又很难获得足量标本。晚期NSCLC的一线治疗中，40%～50%的NSCLC患者能从TKI靶向治疗中获益，如何从无法获取足量组织标本的患者中筛选出适合TKI靶向治疗者是临床医生所面临的问题。理论上负载肿瘤细胞、基因或蛋白的标本均有可能成为肿瘤组织的替代物，如外周血，其取材方便、标本来源充足。有研究显示，以晚期NSCLC患者外周血CTC和血浆为标本，其EGFR突变的检出率分别为92%和33%，提示CTC可能是更好的组织替代标本。研究发现，接受TKI类药物治疗的NSCLC患者CTC携带的基因信息与肿瘤组织具有高度一致性[7]。目前针对外周血CTC及组织标本进行EGFR突变检测的研究较多，但对其EGFR表达的相关研究报道极少[15，16]。因此，本研究以晚期NSCLC患者的外周血为检测标本。

本研究结果显示，晚期NSCLC患者EGFR高表达者有效率及控制率均明显高于EGFR低表达者。说明EGFR高表达者进行TKI类药物靶向治疗的效果优于EGFR低表达者，临床对晚期NSCLC患者可依据CTC的EGFR表达水平判断是否行TKI类药物治疗，该方法可能对无法进行组织EGFR突变检测的患者是一种有效补充。同时本研究发现，EGFR高表达者中位PFS、中位OS和1、2、3年生存率均明显高于EGFR低表达者，表明EGFR高表达的晚期NSCLC患者经TKI类药物靶向治疗后预后更好。

综上所述，外周血CTC中EGFR高表达的晚期NSCLC患者TKI靶向治疗的效果及预后均优于EGFR低表达者。提示检测外周血CTC中的EGFR表达水平有助于临床筛选适合接受TKI靶向治疗的晚期NSCLC患者，从而提高治疗效果。

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云南省科技计划项目(2012FB164)；云南省教育厅科学研究基金项目(2013Z113)。

李高峰(E-mail： ligaofenghl@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.029

R734.2

B

1002-266X(2016)40-0086-03

2016-01-04)