乌司他丁对大鼠脑缺血再灌注后脑组织紧密连接蛋白1及血清神经元特异性烯醇化酶表达的影响Δ

梁晓俊，钟志越，申 捷

(复旦大学附属金山医院重症加强护理病房，上海 201508)



乌司他丁对大鼠脑缺血再灌注后脑组织紧密连接蛋白1及血清神经元特异性烯醇化酶表达的影响Δ

梁晓俊*，钟志越，申 捷

(复旦大学附属金山医院重症加强护理病房，上海 201508)

目的：探讨乌司他丁对缺血再灌注脑损伤的保护作用。方法：选取健康雄性SD大鼠72只，将所有大鼠以随机数字表法分为假手术组、缺血再灌注损伤模型组和乌司他丁处理组，每组各24只。建立大鼠缺血再灌注模型，检测3组大鼠脑组织紧密连接蛋白1(zonula occluden-1，ZO-1)及血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达变化。结果：与缺血再灌注损伤模型组大鼠相比，乌司他丁处理组大鼠脑组织中ZO-1蛋白表达显著增加，NSE表达明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：乌司他丁可通过抑制脑缺血再灌注后血-脑脊液屏障通透性的增加、减少NSE表达而发挥脑保护作用，其保护血-脑脊液屏障的机制可能与增加ZO-1蛋白的表达有关。

乌司他丁； 血脑屏障； 缺血再灌注损伤

心跳骤停是临床最常见的危急情况，随着医疗技术的不断进步，心肺复苏的抢救成功率也不断提高。但复苏后存活者中，仅2%～12%的患者神经功能恢复良好，其他患者会留有或轻或重的脑功能障碍，严重影响生活质量。如何提高脑复苏成功率仍是国内外危重病医学所面临的难题[1-2]。乌司他丁是从人尿中分离纯化的一种蛋白酶抑制剂，能够同时抑制多种酶的活性，具有清除自由基、抑制炎性介质的释放、抑制蛋白质分解代谢等药理作用。研究结果表明，乌司他丁还具有脑保护作用，但具体机制尚未完全明确[3]。有学者认为，乌司他丁可通过减轻血-脑脊液屏障的破坏、降低血-脑脊液屏障的通透性而发挥其脑保护作用[4]。本研究通过建立大鼠心肺复苏模型，观察血-脑脊液屏障变化，采用乌司他丁干预治疗，探讨乌司他丁对缺血再灌注脑损伤的保护作用及机制，为临床治疗提供依据。

1 材料

1.1 药品与试剂

乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司，批准文号：国药准字H20040476，规格：10万U/支)，每支加入0.9%氯化钠溶液10 ml溶解后配置成1万U/ml备用。

1.2 实验动物

实验动物为健康雄性SD大鼠72只，体质量250～300 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。以标准饲料喂养。

1.3 动物模型

将所有大鼠以随机数字表法分为假手术组、缺血再灌注损伤模型组和乌司他丁处理组，每组各24只。采用夹闭双侧颈总动脉合并低血压法建立大鼠全脑缺血再灌注模型。术前禁食8 h，自由饮水。腹腔注射4%水合氯醛350 mg/kg麻醉，经口气管插管，自主呼吸。仰卧位固定，分离双侧颈总动脉、右侧颈总静脉和一侧股动脉。颈总静脉沿心脏方向穿刺置管，用于给药和抽血；股动脉穿刺置管，用以监测血压。用肝素化的注射器经颈总静脉抽取相当于大鼠理论血量30%～35%的静脉血(如体质量250 g的大鼠抽取5.3～6.1 ml静脉血)。维持平均动脉压35～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，用无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，肝素化的静脉血置于37.5 ℃水浴箱中。同时由双侧颞部头皮插入电极描记脑电波，脑缺血模型成功标志为出现静息脑电波(等电位)伴神志丧失，瞳孔散大，颜色苍白，角膜反射和翻正反射消失。夹闭颈总动脉20 min后松开动脉夹恢复灌注并经右颈总静脉缓慢回输血液(速率为1.2 ml/min)；结扎右颈总静脉和一侧股动脉，缝合伤口。假手术组仅分离双侧颈总动脉，不结扎。采用白炽灯照射，维持直肠温37.3～37.7 ℃，待大鼠翻正反射恢复且完全清醒后放回笼中饲养。乌司他丁处理组于再灌注后5 min内给予1万U/kg乌司他丁腹腔注射1次，1日1次。缺血再灌注损伤模型组给予相应体积0.9%氯化钠溶液。

1.4 标本采集

所有大鼠分别于再灌注后6、24、48 h处死，每组每次处死8只，快速断头取脑，采用免疫组化法检测脑组织紧密连接蛋白1(zonula occluden-1，ZO-1)的表达变化，并检测血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 3组大鼠脑组织ZO-1蛋白含量变化比较

ZO-1蛋白在缺血再灌注6 h后表达减少，24 h后明显减少，48 h开始略增加。乌司他丁处理组大鼠脑组织中ZO-1蛋白表达显著高于缺血再灌注损伤模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；乌司他丁处理组、假手术组大鼠脑组织中ZO-1蛋白表达的差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 3组大鼠ZO-1蛋白含量变化比较(μg/g)

2.2 缺血再灌注后6、24、48 h 3组大鼠脑皮层中ZO-1蛋白印迹比较

缺血再灌注后6 h，缺血再灌注损伤模型组、乌司他丁处理组大脑皮层中的ZO-1蛋白表达水平显著低于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；缺血再灌注后24、48 h，假手术组和缺血再灌注损伤模型组皮层中的ZO-1蛋白表达水平仍较低，但乌司他丁组的表达明显升高，见图1。

注：与假手术组比较，*P<0.05；与缺血再灌注损伤模型组比较，#P<0.05Note：vs. sham group，*P<0.05；vs. ischemia-reperfusion injury model group，#P<0.05图1 缺血再灌注6、24、48 h后3组大鼠脑皮层中ZO-1蛋白表达的变化Fig 1 Change of expression of ZO-1 protein in brain cortex of rats after ischemia-reperfusion of 6 h, 24 h and 48 h

2.3 免疫组化观察缺血再灌注后6、24、48 h 3组大鼠脑皮层变化

假手术组ZO-1蛋白表达正常；缺血再灌注损伤模型组6、24、48 h后ZO-1蛋白表达减少；乌司他丁处理组6、24、48 h后ZO-1蛋白表达较假手术组减少，较缺血再灌注损伤模型组明显升高，见图2。

2.4 3组大鼠血清NSE水平的变化

缺血再灌注损伤模型组大鼠血清NSE水平较假手术组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；乌司他丁处理组大鼠治疗后血清NSE水平较缺血再灌注损伤模型组显著降低(P<0.05)，见图3。

3 讨论

脑缺血再灌注损伤现象比较常见，主要是指脑组织缺血一段时间后再恢复血流灌注，脑组织的损害反而会较之前更加明显。再灌注损伤的原因是多种因素相互影响的，其中可能的机制包括氧自由基增多、细胞内钙离子超载、大量释放兴奋性氨基酸、激活蛋白酶、内皮细胞黏附分子的表达、前列腺素水平增高和细胞因子增加等。以上因素导致脑组织内皮细胞损伤，脑内微血管结构发生改变，血-脑脊液屏障的结构和功能遭到严重破坏[5]。多项研究结果表明，缺血再灌注达到3 h，血浆蛋白开始出现外渗，血-脑脊液屏障出现开放；再灌注达到6～12 h，血-脑脊液屏障通透性逐渐增加；再灌注达到24～48 h，血-脑脊液屏障通透性会出现明显增加并达到高峰；再灌注达到72～120 h，血-脑脊液屏障通透性会逐渐减少[6-7]。

A. 假手术组(6 h)；B.假手术组(24 h)；C.假手术组(48 h)；D.缺血再灌注损伤模型组(6 h)；E.缺血再灌注损伤模型组(24 h)；F.缺血再灌注损伤模型组(48 h)；G.乌司他丁处理组(6 h)；H.乌司他丁处理组(24 h)；I.乌司他丁处理组(48 h)A.sham group(6 h)；B.sham group(24 h)；C.sham group(48 h)；D.ischemia-reperfusion injury model group(6 h)；E.ischemia-reperfusion injury model group(24 h)；F.ischemia-reperfusion injury model group(48 h)；G.ulinastatin treatment group(6 h)；H.ulinastatin treatment group(24 h)；I.ulinastatin treatment group(48 h)图2 免疫组化观察缺血再灌注6、24、48 h后3组大鼠脑皮层变化Fig 2 Changes of brain cortex of rats by immunohistochemistry after ischemia-reperfusion of 6 h, 24 h and 48 h

图3 缺血再灌注后3组大鼠血清NSE水平的变化Fig 3 Change of NSE level in three groups after ischemia-reperfusion

ZO-1蛋白是首个被发现且研究最为深入的紧密连接相关蛋白，存在于全部脊椎动物的紧密连接当中[8]。研究表明，ZO-1蛋白表达水平的高低与BBB的损伤程度具有高度相关性，可以用来做为BBB破坏的标志性蛋白[9-10]。NSE是神经元细胞所特有的一种酸性蛋白酶。有资料表明，脑缺血再灌注前，NSE仅存在于中枢神经的胞浆内[11]；缺血再灌注24 h后，NSE从损伤的神经元细胞内漏出，通过血脑屏障进入血液中。因此可以在外周血的血清中检测到NSE水平明显升高。研究表明，血清中的NSE水平可以用来判断脑梗塞急性期脑损伤程度及预后[12]。NSE是显示神经细胞损伤的最敏感标志物，是神经元损害的标志性酶[13]。

乌司他丁是从人类的尿中分离提取的一种蛋白酶抑制剂，可以抑制多种酶的活性。乌司他丁已经被发现具有清除氧自由基、抑制炎症介质的释放、抑制蛋白质的分解代谢等药理作用。近期的研究表明，乌司他丁还具有脑保护作用。有学者发现乌司他丁对控制脑水肿有效，但具体机制尚未完全阐明[14-15]。本研究结果显示，缺血再灌注组大鼠脑组织中ZO-1蛋白有一定的减少，血清NSE显著升高，说明血-脑脊液屏障损害，而接受乌司他丁治疗的大鼠ZO-1蛋白表达增加，血清NSE水平显著降低，说明乌司他丁可直接修复脑微血管内皮细胞间的紧密连接，维护脑组织微环境的稳定，改善血-脑脊液屏障通透性。本研究结果为乌司他丁应用于脑复苏的治疗提供了理论及实验依据。

乌司他丁对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，其可修复血脑屏障中的精密连接蛋白，其机制可能与ZO-1蛋白修复有关。乌司他丁源于人体，不良反应少，安全性高，临床上已广泛应用于胰腺炎、休克、全身炎症反应综合征等的治疗，有显著疗效。

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Effects of Ulinastatin on Expression of Cerebral Cortex Zonula Occluden-1 and Neurone Specific Enolase in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion InjuryΔ

LIANG Xiaojun, ZHONG Zhiyue, SHEN Jie

(ICU of Jinshan Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 201508, China)

OBJECTIVE：To probe into the protective effects of ulinastatin on ischemia-reperfusion injury. METHODS: 72 healthy male SD rats were randomly selected to be divided into sham operation group, schemia-reperfusion injury model group and ulinastatin group, with 24 cases in each. Schemia-reperfusion injury model was established, expression changes of zonula occluden-1(ZO-1) and neurone specific enolase(NSE) in brain tissues of three groups were detected. RESULTS: Compared with schemia-reperfusion injury model group, expression of ZO-1 protein in ulinastatin group significantly increased, while NSE decreased significantly, with statistically significant difference(P<0.05). CONCLUSIONS: Ulinastatin can play a protective role in the brainm by inhibiting the increased cerebral ischemia and reperfusion brain barrier permeability, and reducing expression of NSE; and its protective blood-brain barrier may be related to upregulation expression of ZO-1 protein.

Ulinastatin; Blood-brain barrier; Ischemical reperfusion injury

上海市金山区科学技术创新基金项目(No.2012-3-01)

R96

A

1672-2124(2016)10-1323-04

2016-07-25)

*主治医师。研究方向：危重病。E-mail：xiaonijl@163.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.10.009