木香药材的高效液相色谱特征图谱研究Δ

庞道然，彭治添，晁凌会，任 易，张 媛，李 军

(1.北京中医药大学中药现代研究中心，北京 100029； 2.北京中医药大学中药学院，北京 100102)



木香药材的高效液相色谱特征图谱研究Δ

庞道然1，2*，彭治添1，2，晁凌会1，2，任 易1，2，张 媛2，李 军1#

(1.北京中医药大学中药现代研究中心，北京 100029； 2.北京中医药大学中药学院，北京 100102)

目的：建立木香药材高效液相色谱特征图谱分析方法。方法：采用Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)为流动相梯度洗脱，流速1.0 ml/min，检测波长254 nm，柱温25 ℃，建立不同产地木香的高效液相色谱特征图谱；采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004 A版)进行相似度评价。结果：通过对15批次不同产地木香样品的分析，建立了木香药材高效液相色谱特征图谱，确定了6个共有特征峰，并指认了其中2个特征峰的结构，分别为木香烃内酯和去氢木香内酯。结论：本研究建立的木香药材特征图谱的特征性和专属性强，且方法简便、可靠，重复性好，为更好地控制木香药材的内在质量提供了科学依据。

木香； 特征图谱； 高效液相色谱； 质量控制

木香为菊科植物木香AucklandialappaDecne.的干燥根，为常用中药，始载于《神农本草经》，被列为上品[1-2]。其性温，味辛、苦，归脾、胃、大肠、三焦、胆经，具有行气止痛、健脾消食的功效，临床用于胸胁、脘腹胀痛，泻痢后重，食积不消，不思饮食等症状[3]。木香烃内酯和去氢木香内酯等倍半萜内酯类化合物为木香的主要成分，也是其重要的活性成分[4-6]。《中华人民共和国药典》(2015年版)只规定了木香烃内酯和去氢木香内酯的含量测定，在木香品种选育及药材质量控制研究时，该方法不足以全面反映木香药材的内在质量。中药特征图谱是中药整体性的化学表征，是一种多指标的质量控制模式，它可以比较全面地反映所含化学成分的种类和数量，从而全面、综合地反映和控制中药材的质量[7]。本研究通过对15批次不同产地的木香药材采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)进行分析，建立了木香药材特征图谱，以对照药材为随行对照，用于鉴别木香药材的真伪，为该药材的鉴别及质量评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器

岛津分析型HPLC仪(包括二极管阵列检测器、二元高压梯度泵、真空脱气机、柱温箱、自动进样器；Labsolution色谱工作站)(日本岛津公司)；超声波清洗器(南京垒君达超声电子设备有限公司)；METTLER XS105型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

15批木香(来源见表1)药材经北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定为菊科植物木香AucklandialappaDecne.的干燥根；木香对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：120921-201309)；木香烃内酯(中国食品药品检定研究院，批号：111524-201208)；去氢木香内酯(上海诗丹德生物技术有限公司，批号：STA-24143003)；甲醇(北京化工厂，分析纯)；甲酸(赛默飞世尔科技有限公司，色谱纯)；甲醇、乙腈(赛默飞世尔科技有限公司，色谱纯)；水为Milli-Q超纯水。

表1 15批次木香样品的来源和相似度

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18分析色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B)梯度洗脱(洗脱梯度见表2)；流速1.0 ml/min；进样量10 μl；柱温25 ℃；检测波长254 nm。理论板数按木香烃内酯峰计算应不低于3 000。

表2 洗脱梯度

2.2 对照品溶液的制备

取木香烃内酯和去氢木香内酯对照品适量，精密称定，分别置于1.0 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度。再分别吸取上述对照品储备液适量置于1.0 ml容量瓶中，加甲醇制成每1.0 ml含木香烃内酯250 μg和去氢木香烃内酯320 μg的混合溶液作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取木香粉末(过四号筛)约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 ml，称定质量，浸泡30 min，超声处理60 min，静置30 min，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，取上清液过0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 精密度试验

取木香粉末约0.5 g，按“2.3”项下方法制备，在相同色谱条件下连续进样6次，将所得的色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较。以色谱峰3(木香烃内酯)为参照峰，计算其他5个色谱峰的相对保留时间。结果显示，连续进样6次所得的色谱图相似度均>0.95。计算各色谱峰与峰3的相对保留时间，其相对保留时间均在规定值的±5%之内，且相对保留时间的RSD<2%，说明该方法的精密度符合分析方法的要求。

2.5 稳定性试验

取木香粉末约0.5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样检测，将所得的色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较。以色谱峰3(木香烃内酯)为参照峰，计算其他5个色谱峰的相对保留时间。结果显示，各色谱图的相似度均>0.95。计算各色谱峰与峰3的相对保留时间，其相对保留时间均在规定值的±5%之内，且相对保留时间的RSD<2%，说明供试品溶液的成分在24 h内是稳定的。

2.6 重复性试验

取木香粉末约0.5 g，按“2.3”项下方法平行操作6次，制备6份供试品溶液，将所得供试品溶液分别进样，将所得的色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较。以色谱峰3(木香烃内酯)为参照峰，计算其他5个色谱峰的相对保留时间。结果显示，各色谱图的相似度均>0.95。计算各色谱峰与峰3的相对保留时间，其相对保留时间均在规定值的±5%之内，且相对保留时间的RSD<2%，说明该方法的重复性好。

2.7 特征图谱的建立

将15批次各地的木香药材，分别按照“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析。将所得的各色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004 A版)中进行数据处理。以S3为参照图谱，时间窗为0.1 min，中位数法，经多点校正自动匹配生成木香药材对照特征图谱，结果见图1—2。

图1 15批次木香药材样品HPLC特征图谱Fig 1 Overlapped HPLC characteristic fingerprints of 15 batches of Aucklandia Radix

图2 木香药材对照特征图谱Fig 2 Reference characteristic fingerprints of Aucklandia Radix

通过对15批次木香药材特征图谱分析，发现1—6号峰为所有样品溶液色谱图中共有色谱峰，且峰面积相对较大、与各自相邻峰的分离度大。因此，确定此6个色谱峰为木香特征图谱的共有特征峰。以色谱峰3(木香烃内酯)为参照峰，计算其他5个色谱峰的相对保留时间，结果见表3。

在相同的色谱条件下，将木香对照药材按“2.3”项下的方法制备对照药材溶液，进样分析，所得结果见图3(B)。将标准品溶液进样分析，并与样品特征图谱中相应色谱峰进行比较，确定样品特征图谱中的峰3、4分别为木香烃内酯和去氢木香烃内酯，见图3(C)。

2.8 特征图谱相似度评价

将15批次样品色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004 A版)进行数据处理，得到木香药材样品HPLC对照特征图谱(图2)。计算15批次供试品色谱图和对照图谱之间的相似度，结果见表1，15批次样品相似度均>0.90，说明本实验收集的15批次木香药材质量均较好，一定程度上反应了市场上流通的木香药材质量较好。

表3 15批次木香样品特征图谱中6个共有特征峰的相对保留时间

A.样品；B.对照药材；C.混合对照品；3.木香烃内酯；4.去氢木香内酯A.Sample(S3)；B.Reference herb；C.Reference substance；3.Costunolide；4.Dehydrocostus lactone图3 木香药材、对照药材和对照品的HPLC图Fig 3 HPLC chromatagrams of Aucklandia Radix samples, reference herb and reference substance

3 讨论

对15批次样品预试验时发现，3号木香药材样品的色谱峰最多，因此用3号样品进行了分析方法建立研究。分析方法建立过程中，考察了不同色谱条件，包括色谱柱、检测波长、流动相、洗脱梯度、进样量、柱温、流速对色谱峰分离度和峰形等的影响。最后优化的色谱条件为Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脱；柱温25 ℃；进样量10 μl；流速1.0 ml/min；检测波长254 nm。同时还考察了提取溶剂、提取方法和提取时间对木香中化学成分提取效率的影响。结果表明，以70%甲醇作为提取溶剂，在超声提取60 min的条件下，提取效率较高且方法简便。实验中还发现，超声提取前浸泡30 min，实验重复性好，有利于更充分地提取样品。

本实验采用建立的色谱分析方法对市场上收集的15批次木香药材进行了分析，建立了木香药材的特征图谱。通过相似度软件分析发现，15批次不同产地的木香药材特征图谱相似度较高，均>0.90，说明不同产地木香药材的化学成分基本一致，但是各色谱峰对应的化学成分在含量上有一定的差异。通过对15批次样品色谱图中色谱峰的分析，确定了6个共有特征峰，通过与混合对照品溶液对照，鉴定其中2个共有特征峰的结构分别为木香烃内酯和去氢木香内酯。其中，3号峰的峰面积较大，且分离度与对称性均良好，因此将3号峰作为参照峰S，计算各批次样品中共有特征峰的相对保留时间。结果显示，峰1、2、4、5、6的相对保留时间分别为0.392 6、0.400 8、1.043 2、1.307 9、1.328 8。在相同的色谱条件下，木香对照药材的色谱图中也呈现与对照特征图谱中共有特征峰相应的6个色谱峰。在木香药材的鉴别检测中，通过对照药材随行对照，采用特征图谱能够实现对木香药材的真假鉴别。因此，在药材的质量评价过程中，应将特征图谱与药典的检测项目结合起来，真正做到控制木香药材及其相关制剂质量。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：62.

[2]魏华，彭勇，马国需，等.木香有效成分及药理作用研究进展[J].中草药，2012，43(3)：613-620.

[3]李力，张振秋，王冰，等.木香药材HPLC指纹图谱的研究[J].中成药，2011，33(6)：925-928.

[4]尹宏权，齐秀兰，华会明，等.云木香化学成分研究[J].中国药物化学杂志，2005，15(4)：217-220.

[5]辛玥，丁亚辉，纪庆，等.木香烃内酯对K562/A02细胞阿霉素耐药的逆转作用研究[J].现代药物与临床，2016，31(6)：742-746.

[6]孙文利，张晓旭，黄志英，等.去氢木香内酯对实验性大鼠肝损伤的保护作用[J].世界中医药，2015，10(3)：399-402.

[7]秦红霖，李永申.特征图谱技术在中药质量分析中的应用[J].中国实用医药，2014，9(7)：253-255.

Study on Characteristic Fingerprint of Aucklandia Radix by HPLCΔ

PANG Daoran1,2，PENG Zhitian1,2，CHAO Linghui1,2，REN Yi1,2，ZHANG Yuan2，LI Jun1,*

(1.Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2.School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China)

OBJECTIVE：To establish the HPLC characteristic fingerprint for the quality control of Aucklandia Radix. METHODS: Diamonsil C18chromatographic column(250 mm×4.6 mm, 5 μm) was adopted, the mobile phase consists of methanol(A) and water containing 0.1% acetic acid(B) with gradient elution at the flow rate of 1.0 ml/min. The UV detection wavelength was 254 nm and the column temperature was 25 ℃. The Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine (version 2004A) was used to calculate the similarity of the HPLC characteristic fingerprint of Aucklandia Radix from different habitats. RESULTS: HPLC characteristic fingerprint was established with six common characteristic peaks based on the analysis of 15 batches of Aucklandia Radix. Two common characteristic peaks were identified as costunolide and dehydrocostus lactone. CONCLUSIONS: The established method shows good characteristics, specificity, and repeatability, which can provide a scientific basis for the identification and quality control of Aucklandia Radix.

Aucklandia Radix; Characteristic fingerprint; HPLC; Quality control

国家工信部中药材扶持项目；教育部新世纪优秀人才支持计划资助项目(No.NCET-13-0693)

R931

A

1672-2124(2016)10-1300-04

2016-08-28)

*硕士研究生。研究方向：中药药效物质基础和质量评价研究。E-mail：pangdaoran1992@163.com

#通信作者：副研究员，硕士生导师。研究方向：中药药效物质、作用机制和质量评价。 E-mail：drlj666@163.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.10.002