Th17及Treg相关因子在反复种植失败患者种植窗口期子宫内膜中的表达

艾海权，腊晓琳，巩晓芸，李霞，朱玥洁，丁剑冰，玛依热·吐尔逊*

(1. 新疆医科大学第一附属医院妇科生殖助孕中心生殖医学科，乌鲁木齐 830054；2. 新疆医科大学基础医学院免疫教研室，乌鲁木齐 830011)



Th17及Treg相关因子在反复种植失败患者种植窗口期子宫内膜中的表达

艾海权1，腊晓琳1，巩晓芸1，李霞1，朱玥洁1，丁剑冰2，玛依热·吐尔逊1*

(1. 新疆医科大学第一附属医院妇科生殖助孕中心生殖医学科，乌鲁木齐 830054；2. 新疆医科大学基础医学院免疫教研室，乌鲁木齐 830011)

目的 通过研究种植窗口期子宫内膜中Treg及Th17特异性转录因子及相关细胞因子表达情况，探讨反复种植失败患者子宫内膜中Treg/Th17平衡调节的可能机制。 方法 建立种植窗口期子宫内膜标本库。从标本库选择2013年10月至2014年12月收集的符合实验要求的反复种植失败患者(实验组)及首次移植妊娠患者(对照组)各20例，采用定量RT-PCR测量内膜标本中的Treg、Th17特异性表达因子Foxp3和ROR-γt及相关细胞因子IL-10、IL-17表达情况。 结果 在实验组和对照组子宫内膜上均可见Foxp3、ROR-γt及细胞因子IL-10、IL-17表达；与对照组比较，实验组Foxp3 mRNA的相对表达量[(0.77±0.15) vs.(1.57±1.22)]及IL-10 mRNA的相对表达量[(1.14±1.03) vs.(1.54±1.77)]均显著降低(P<0.05)，而ROR-γt mRNA的相对表达量[(0.92±0.39) vs.(0.55±0.15)]及IL-17 mRNA的相对表达量[(0.95±0.31) vs.(0.49±0.21)]均显著升高(P<0.05)。 结论 IL-17、IL-10可能参与内膜中Th17/Treg平衡调节。

Treg； Th17； 反复种植失败； 子宫内膜容受性； 种植窗

Methods：The endometrial specimens bank in the implantation window phase was established. A total of 40 specimens met the experimental requirements were collected from October 2013 to December 2014. Among them，20 specimens were from the patients with repeated implantation failure as experimental group，and another 20 specimens from the pregnancy patients in their first transplantation as the control group. The expressions of Foxp3，ROR-γt，IL-10，and IL-17 in endometrial specimens were measured by quantitative RT-PCR.

Results：Foxp3，ROR-γt，IL-10，and IL-17 in endometrium were expressed in both experimental group and control group. The mRNA expressions of Foxp3(0.77 ± 0.15 vs. 1.57 ± 1.22)and IL-10(1.14 ± 1.03 vs. 1.54 ± 1.77)in the experimental group were significantly lower than those in the control group (P<0.05). The mRNA expressions of ROR-γt(0.92 ± 0.39 vs. 0.55 ± 0.15)and IL-17(0.95 ± 0.31 vs. 0.49 ± 0.21) in the experimental group were significantly higher than those in the control group (P<0.05).

Conclusions：IL-10 and IL-17 may involve in regulation balance of Th17/Treg.

(JReprodMed2016，25(11)：1013-1017)

不孕症严重影响患者的身心健康，己成为一个重要的医学和社会问题。辅助生殖技术(ART)为不孕症治疗开辟了新篇章，随着这一技术及其衍生技术的飞速发展，治疗周期中获得优质胚胎的数量增多，但临床妊娠率却始终徘徊在40%～70%，而且胚胎种植率一直波动于25%～35%之间。胚胎种植失败成为辅助生殖治疗失败的最大原因。在排除宫腔形态异常、染色体异常、输卵管积水、子宫内膜病变等因素后，多次移植优质胚胎仍未妊娠，称为反复种植失败(RIF)，在ART治疗中的发生率约为10%[1]。

胚胎种植是一种成功的半同种移植，有赖于免疫系统的调节[2-3]，RIF可能与机体的同种免疫功能异常有关[4]。Treg/Th17平衡在反复自然流产患者中的作用已被证实，但Treg/Th17平衡是否参与胚胎种植过程中的免疫调节及其机理尚不明确。本研究通过比较RIF患者种植窗口期子宫内膜中Treg及Th17特异性转录因子及相关细胞因子的表达情况，探讨RIF患者子宫内膜中Treg/Th17平衡调节的可能机制。

资料与方法

一、研究对象

1.建立标本库：在进行该研究前严格建立标本库。对于拟在我中心行助孕治疗的不孕症夫妇完全按照患者知情同意并自愿原则下采集子宫内膜标本。

黄体中期(B超监测排卵后6～8 d)采集子宫内膜标本。所取子宫内膜标本经生理盐水反复冲洗后，一式3份置入冻存管，立即冻存于液氮罐中。所有标本采集后加以相应处理，最后转移至我院医学研究中心标本库-80℃低温冰箱内统一保存以备用。

2.选取研究对象：从标本库中选取符合实验要求的实验组及对照组各20例。实验组为符合RIF诊断标准(在我院至少3次移植优质胚胎均未孕)的患者，对照组为第1次移植1～2枚优质胚胎即妊娠的患者。

纳入标准：患者年龄35岁以下，均有1次或1次以上IVF/ICSI治疗史，均有优质的胚胎移植，月经规律，内分泌正常。

排除标准：子宫内膜病变、宫腔形态异常、输卵管积水、卵巢反应不良、染色体异常、性传播疾病、抗精子抗体、抗子宫内膜抗体、抗心磷脂抗体、抗卵巢抗体阳性的患者[1]。

严密跟踪随访不孕症夫妇治疗结局。

二、研究方法

1.总RNA提取及RNA纯度和浓度鉴定：所有用品均严格按消除RNase的常规方法处理。严格按照Trizol(Invitrogen，美国)说明书操作提取子宫内膜组织总RNA。将所提取的内膜组织总RNA用适量DEPC水稀释后，用分光光度计ND1000(NanoDrop，美国)定量，测其OD 260与OD 280值，并计算OD 260/OD 280，当此比值在1.8～2.0时，说明提取的RNA较纯，无残余蛋白质和DNA。另外，根据OD260值可以计算RNA浓度：RNA(μg/μl)=OD 260×稀释倍数×40/1 000[5]。

2.反转录合成cDNA及电泳鉴定：严格按照反转录试剂盒(Fermentas，加拿大)说明书操作步骤反转RNA为cDNA。

3.引物设计和合成：从GeneBank中检索人Foxp3、ROR-γt、IL-10、IL-17和GAPDH基因引物序列，在线Genbank查找目的基因Foxp3、ROR-γt和IL-10、IL-17cDNA序列，应用DNA MAN软件设计引物(表1)。引物由上海生工生物公司合成。

表1 定量RT-PCR所用的基因引物

4.实时荧光定量PCR：Foxp3反应参数为预变性95 ℃30 s，95 ℃15 s、56 ℃30 s；ROR-γt反应参数为预变性95 ℃ 30 s，95 ℃15 s、54.4 ℃30 s；IL-10反应参数为预变性95 ℃30 s，95 ℃15 s、56.5 ℃ 30 s；IL-17反应参数为预变性95 ℃30 s，95 ℃15 s、55.5 ℃30 s；GAPDH反应参数为预变性95 ℃30 s，95℃15 s、58 ℃30 s。反应45个循环。并绘制熔解曲线，记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即Ct值，每个样本设2个复孔。采用相对定量法2﹣ΔΔCt法(2﹣ΔΔCt法：实验每次重复2次，取平均值。然后算出每个样本该基因相对与内参的变化，即用对照组或RIF组Ct值减去内参Ct值得到ΔCt)处理定量PCR数据，确定特定荧光阈值对应循环数的Ct值，对目标基因定量[5]。

三、统计学分析

采用SPSS17.0进行统计学分析，正态性检验和方差齐性检验后，计量资料以均数±标准差表示，两组资料用独立样本t检验；检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。所有数据图表采用GraphPad Prism 5.0软件绘图。

结 果

一、一般资料

实验组20例，年龄21.5～34.5岁，平均(29.6±3.8)岁，原发不孕13例，继发不孕7例，不孕年限1.0～7.9年，平均(3.1±2.6)年；对照组20例，年龄20.8～34.8岁，平均(30.4±3.5)岁，原发不孕11例，继发不孕9例，不孕年限1.2～8.6年，平均(3.4±2.9)年。两组在年龄、不育年限、基础内分泌3项及体重指数(BMI)均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

二、定量RT-PCR结果

Foxp3及IL-10的mRNA相对表达水平在对照组显著高于实验组(RIF组)(P<0.01)，而ROR-γt及IL-17的mRNA相对表达水平在对照组显著低于实验组(P<0.01)(图1、表3)。

表2 两组患者一般资料比较 (x-±s)

组别Foxp3IL-10ROR-γtIL-17对照组1.57±1.221.54±1.170.55±0.150.49±0.21实验组0.77±0.15*1.14±1.03*0.92±0.39*0.95±0.31*

注：与对照组比较，*P<0.01

讨 论

正常妊娠时精子与卵母细胞在输卵管内受精形成受精卵进一步发育到达宫腔，胚胎在子宫内膜定位、粘附、侵入并使内膜间质发生改变从而使胚胎着床的时间为排卵后6～7 d。大部分研究认为排卵后6～7 d时子宫内膜接受胚胎的能力达到最大，在其他时间子宫内膜对胚胎处于不容受阶段，因此把这一时期定义为“种植窗口期”[6-7]。ART过程中通常将所获得的胚胎在种植窗口期前植入子宫，胚胎在子宫腔内与子宫内膜相互适应并植入子宫内膜。但对于多次移植失败的患者，无论经济上和精神上都承受着极大的打击，给患者本人及其家庭均带来极大的经济及精神负担。因此关于此期间子宫内膜的研究越来越多，本研究中实验组为3次移植每次至少1枚优胚而未孕者，且排除其他影响胚胎种植的因素，故考虑胚胎种植失败可能与此期间内膜容受有关。

胚胎是来自母体的卵母细胞和来自父系的精子结合的产物，它携带1/2有异于母体的组织抗原，被认为是一种半同种异体抗原，胚胎植入过程受胚胎及子宫内膜的免疫细胞共同调节，母体对胚胎抗原的免疫排斥和内膜对胚胎抗原的免疫耐受达到平衡才可能使胚胎顺利着床，当这种平衡偏向免疫排斥从而出现炎症反应或免疫反应时就可能导致胚胎种植失败[4]。

Treg细胞来源于naive T细胞，可诱导机体产生免疫耐受，具有独特的免疫调节功能。Foxp3为Treg细胞特异性转录因子，在Treg活化和免疫调节功能中发挥主导作用，同时Foxp3可反映Treg细胞的活性水平[8-9]。Shima等[10]报道，母体的Treg能抑制半同种抗原引起的母体对胚胎的免疫排斥反应，在胚胎种植期及妊娠早期维持妊娠免疫耐受起重要作用。娄华等[4]通过比较淋巴细胞主动免疫治疗对RIF患者外周血Treg表达的影响，最后认为RIF的发生可能与Treg的表达下降有关。Th17细胞同样来源于naive T细胞，但与Treg细胞属于两种不同作用的细胞亚群，Th17主要介导炎症反应，控制Th17细胞分化的重要转录因子为ROR-γt[8]。Wang等[11]研究发现与正常妊娠妇女相比，反复自然流产患者外周血及蜕膜中Thl7细胞数量剧增，并且Thl7/Treg比例失衡[12]。

Th17及Treg细胞在数量上保持动态平衡，在功能上相互影响相互制约[13-14]。Treg细胞可通过分泌抑制性细胞因子IL-10发挥抗炎和维持自身免疫耐受[8，15]。IL-10在机体内参与炎性反应和免疫反应，是目前公认的炎症与免疫抑制因子，而IL-17是由Th17细胞分泌的特征性细胞因子，在诱导炎症的发生和自身免疫性疾病的发病机制中起重要作用[8]，IL-17 的表达可抑制Treg 增殖[14]。有研究发现复发性流产患者绒毛滋养细胞中IL-10的表达量明显低于正常妊娠妇女[16]，也有研究发现复发性流产妇女蜕膜组织中IL-17表达明显高于正常妊娠[17]。因此，在Treg/Th17细胞模式中RIF患者可能通过调节IL-10和IL-17的表达而引起其失衡[14，17]。

近年来Treg/Thl7平衡在生殖领域研究越来越多，但子宫内膜局部的Treg及Th17的研究尚少。我们前期采用免疫组化研究种植窗口期子宫内膜标本中Treg及Th17细胞表达情况，发现在RIF患者及首次移植妊娠患者子宫内膜上均可见Foxp3和ROR-γt表达，且主要表达于细胞胞浆和细胞膜，但RIF患者内膜中的Treg/Thl7平衡偏向Thl7，首次移植妊娠者内膜中的Treg/Thl7平衡偏向Treg，提示Treg/Thl7平衡可能参与胚胎种植的免疫过程(未发表资料)。本研究进一步通过对种植窗口期子宫内膜标本采用定量RT-PCR测量Treg及Th17的特异转录因子Foxp3和ROR-γt的表达，发现在首次移植妊娠组Foxp3表达增加、ROR-γt表达下降，Treg/Th17比值增加，而反复种植失败组的Treg/Th17比值下降，与文献报道中的外周血Treg/Th17平衡一致[4]，也印证了我们前期的实验结果。同时本研究中还发现作为炎症和免疫抑制的重要细胞因子IL-10在首次移植妊娠组表达增加，而参与炎症反应的重要细胞因子IL-17在反复种植失败组表达增加，与文献报道中的在Treg/Th17细胞模式中RIF患者可能通过调节IL-10和IL-17的表达而引起其失衡结论一致[14，17]。

综上所述，IL-17、IL-10可能参与种植窗口期子宫内膜局部Th17/Treg平衡调节。但由于本研究中例数较少，尚需进一步完善。

[1] 刘春喜.Treg细胞及相关因子对胚胎反复种植失败的影响[D].郑州大学，2010.

[2] 王宁，姜凤良.Th1/Th2，Th17/Treg细胞与母胎免疫耐受和病理妊娠[J].中国免疫学杂志，2016，32：136-139.

[3] 黄千贻，李慕军.Treg/Th17平衡与复发性流产[J].中国免疫学杂志，2015，31：1422-1425.

[4] 娄华，王兴玲，王雪梅，等.主动免疫治疗对反复胚胎植入失败患者CD4+CD25+调节性T细胞表达的影响[J].生殖医学杂志，2012，21：440-442.

[5] 侯敏.维药神香草对哮喘大鼠炎性因子和Th17细胞相关因子的影响[D].新疆医科大学，2010.

[6] Diedrich K，Fauser BC，Devroey P，et al.The role of the endometrium and embryo in human implantation[J]. Hum Reprod Update，2007，13：365-377.

[7] 刘倍余，李洁，黎明涛，等.反复种植失败妇女“种植窗”时期子宫内膜组织的细胞骨架蛋白质的差异表达[J].生殖医学杂志，2014，23：907-912.

[8] 陈丹，孟昱时.Thl7和Treg细胞在不明原因复发性流产中的研究进展[J].中国生育健康杂志，2016，27：296-299.

[9] Clark DA，Chaouat G. Regulatory T cells and reproduction：how do they do it[J]. J Reprod Immunol，2012，96：l-7.

[10] Shima T，Sasaki Y，Itoh M，et a1.Regulatory T cells are necessary for implantation and maintenance of early pregnancy but not late pregnancy in allogeneic mice[J].J Reprod Immunol，2010，85：121-129.

[11] Wang WJ，Hao CF，Yi Lin，et al. Increased prevalence of T helper 17(Thl7)cells in peripheral blood and decidua in unexplained recurrent spontaneous abortion patients[J].J Reprod Immunol，2010，84：164-170.

[12] 张琚，杨菁. Thl7/Treg免疫失衡与原因不明复发性流产关系的研究进展[J].生殖医学杂志，2015，24：960-964.

[13] Lee SK，Kin JY，Lee M，et al. Th17 and regulatory T cells in women with recurrent pregnancy loss[J].Am J Repord Immunol，2012，67：311-318.

[14] 吴梦茹，朱玥洁，丁剑冰，等.不明原因反复性自发流产与免疫细胞失衡的关系[J].细胞与分子免疫学杂志，2015，31：1144-1147.

[15] La Rocca C，Carbone F，Longobardi S，et al.The immunology of pregnancy：regulatory T cells control maternal immune tolerance toward the fetus[J]. Immunol Lett，2014，162：41-48.

[16] Hosseini S，Zarnani AH，Asgarian-Omran H，et al.Comparative analysis of NK cell subsets in menstrual and peripheral blood of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion and fertile subjects[J].J Reprod Immunol，2014，103：9-17.

[17] Wang WJ，Liu FJ，Qu HM，et al. Regulation of the expression of Th17 cells and regulatory T cells by IL-27 in patients with unexplained early recurrent miscarriage[J].J Reprod Immunol，2013，99：39-45.

[编辑：罗宏志]

Expression of Th17 and Treg in endometrium during implantation window phase in patients with repeated implant failure

AI Hai-quan1，LA Xiao-lin1，GONG Xiao-yun1，LI Xia1，ZHU Yue-jie1，DING Jian-bing2，MA Yi-re·Tu-er-xun1*

1.DepartmentofReproductiveMedicine，theFirstaffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054 2.DepartmentofImmunology，SchoolofBasicMedicalSciences，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011

Objective：To investigate the expression of specific transcription factors and related cytokines of Treg and Th17 in the endometrium，and explore the mechanism of regulation balance of Th17/Treg in patients with repeated implant failure.

Treg；Th17； Repeated implantation failure； Endometrial receptivity； Implantation window

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.11.012

2016-07-06；

2016-08-22

新疆医科大学第一附属医院自然基金重点项目(2013ZRZD019)

艾海权，女，湖北浠水人，硕士，主治医师/讲师，生殖医学专业.(*