miRNA-21对脂多糖诱导大鼠心肌细胞增殖的影响及其机制探讨

王圆,黄燕,杨丹英,姜虹

(1上海交通大学医学院附属第九人民医院,上海200011；2上海交通大学医学院附属新华医院)



miRNA-21对脂多糖诱导大鼠心肌细胞增殖的影响及其机制探讨

王圆1,黄燕1,杨丹英2,姜虹1

(1上海交通大学医学院附属第九人民医院,上海200011；2上海交通大学医学院附属新华医院)

目的 观察微小RNA-21(miRNA-21)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠心肌细胞增殖的影响，并探讨其可能机制。方法 取大鼠心肌细胞H9C2，用LPS 10 μg/mL处理0、6、12 h，RT-PCR法检测细胞miRNA-21表达。将对数生长期的H9C2细胞随机分为4组，A组不处理，B组用LPS 10 μg/mL处理12 h；C、D组分别转染对照质粒(NCmiRNA片段)、miRNA-21抑制质粒(miRNA-21 antagomiR)，培养48 h后再用LPS 10 μg/mL处理12 h。 采用CCK-8法检测各组H9C2细胞增殖的OD值，Western blot法检测H9C2细胞中Bax、Bcl-2蛋白，分光光度法检测H9C2细胞中Caspase-3活性。结果 LPS处理0、6、12 h时，H9C2细胞miRNA-21相对表达量分别为1.05±0.03、12.95±0.08、19.62±0.12；与0 h时比较，6、12 h时H9C2细胞miRNA-21相对表达量升高(P均<0.01)。A、B、C、D组H9C2细胞增殖的OD值分别为1.08±0.03、0.71±0.03、0.70±0.01、0.85±0.02，A组﹥D组﹥B、C组，P均﹤0.01。与A组比较，B、C、D组H9C2细胞中Bax相对表达量增加、Bcl-2相对表达量降低(P均﹤0.01)；与B、C组比较，D组H9C2细胞中Bax相对表达量减少、Bcl-2相对表达量增加(P均﹤0.01)。B、C、D组H9C2细胞Caspase-3活性分别为1.13±0.08、1.10±0.14、0.57±0.06，D组H9C2细胞Caspase-3活性低于B、C组，P均﹤0.01。结论 LPS可致心肌细胞损害过程miRNA-21表达增加，抑制miRNA-21表达可减轻LPS对心肌细胞增殖的抑制作用；其机制为抑制miRNA-21表达可下调Bax蛋白、上调Bcl-2蛋白表达，抑制Caspase-3活性，从而减轻细胞凋亡。

微小核糖核酸21；脂多糖；心肌细胞；细胞增殖；凋亡相关蛋白；脓毒血症；大鼠

脓毒血症作为由各类致病微生物在体内积聚导致机体出现炎性状态的全身炎症反应综合征(SIRS)，若未进行及时治疗则会出现多器官功能衰竭，危及生命，影响预后[1,2]。而心肌损伤是脓毒血症及脓毒性休克时最危险的并发症，严重影响心脏功能，其造成的难治性低血压是脓毒血症死亡的重要因素。因此，预防和治疗心肌损伤成为脓毒血症治疗的重要组成部分[3]。微小RNA(miRNA)是一种存在于真核生物中长度约为22个核苷酸大小的非编码单链小分子RNA，可特异性识别目的mRNA的3′非编码区(3′UTR)并与之结合，从而降解目的mRNA或抑制翻译，调节重要的细胞活动，参与众多疾病的病理生理过程[4]。研究表明，miRNA广泛参与人体生长发育、免疫应答及炎症反应等生理过程，并且参与心血管疾病、肿瘤和感染等疾病调控过程[5～7]。miRNA-21已被证实参与缺血再灌注、心脏肥大等心脏疾病调控[8,9]。但是，目前涉及miRNA-21与脓毒血症心肌损伤之间的研究甚少。2015年4月～2016年3月，我们观察了miRNA-21对脂多糖(LPS)诱导的心肌细胞增殖的影响，并探讨其可能的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 大鼠胚胎心肌细胞 H9C2购自中国科学院上海细胞库;DMEM、胎牛血清(FBS)、0.05%胰酶/乙二胺四乙酸(EDTA)、Hanks液均购自美国Gibco公司；TRIzol、Lipofectamine2000转染试剂、焦碳酸二乙酯 (DEPC)水购自美国Invitrogen公司；miRNA-21抑制质粒(miRNA-21 antagomiR)购自广州瑞博公司；miScript Reverse Transcription Kit购自荷兰Qiagen公司；PCR试剂盒购自美国Life公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Pierce公司；酶标仪ECX800购自美国Bio-TEX公司；Bax、Bcl-2、Caspase-3检测试剂盒购自南京凯基公司；CCK-8细胞计数试剂盒购自日本同仁化学研究所；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将H9C2细胞置于含10%FBS的DMEM(高糖)培养基中，于37 ℃、5% CO2孵箱中培养。当细胞铺满培养皿时，用1～2 mL PBS冲洗2遍；加1 mL胰酶消化1 min，再加含10%血清培养液终止消化。将细胞悬液移至15 mL离心管，500 g离心3 min；倒去上清，将细胞稀释后按1∶3的比例分到新皿。

1.2.2 H9C2细胞miRNA-21检测 取对数生长期的H9C2细胞，分别于LPS 10 μg/mL处理0、6、12 h时收集细胞，采用RT-PCR法检测miRNA-21。按产品说明书用TRIzol裂解细胞，氯仿抽提细胞总RNA。逆转录反应合成模板cDNA，-20 ℃保存。以20 μL反应体系进行PCR，取2 μL逆转录反应产物分别与miR-21引物和内参照U6引物进行反应。miR-21引物序列:上游5′-CCTGCCTGAGCACCTCGTGC-3′，下游5′-GACTGTGACGACTACCCCAA-3′；U6引物序列：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环40次。在ABI 7300 PCR System上操作反应，采用2-ΔΔCt法计算目的基因与内参照的比值，以此表示目的基因相对表达量。

1.2.3 H9C2细胞增殖活性观察 采用CCK-8法。将细胞制成单细胞悬液，以1×105/孔接种至6孔板。当细胞生长融合达60%～70%后，随机分为4组。A组不处理，B组用LPS 10 μg/mL处理12 h；C、D组分别以Lipofectamine2000转染对照质粒(NCmiRNA片段)、miRNA-21抑制质粒(miRNA-21 antagomiR)，在37 ℃，5%CO2的孵箱中培养48 h后再用LPS 10 μg/mL处理12 h。 每孔加CCK-8试剂，继续培养4 h，用酶标仪测490 nm的光密度(OD)值。

1.2.4 H9C2细胞Bax、Bcl-2蛋白检测 采用Western blot法。取1.2.3中各组细胞，用含有10%磷酸酶抑制剂和1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的细胞裂解液裂解细胞。用BCA蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白定量，15%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。用5%牛血清白蛋白(BSA)室温下封闭4 h，4 ℃孵育一抗Bax、Bcl-2、GAPDH过夜。TBST洗涤3次，每次15 min。室温下孵育二抗1～2 h，TBST洗涤3次，每次15 min。Image Quant LAS4000mini显影，以目的蛋白与GAPDH蛋白条带OD比值表示目的蛋白相对表达量。

1.2.5 H9C2细胞Caspase-3活性测定 采用分光光度法。取1.2.3中各组细胞，用胰酶消化；4 ℃下2 000 g离心5 min，收集细胞；吸除上清，PBS洗涤1次。吸尽上清后，按照每2×107个细胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min。4 ℃下16 000 g离心15 min，把上清转移到冰浴预冷的离心管中。按照试剂盒的说明检测Caspase-3活性。在酶标仪上测定波长在405 nm处的OD405值，以各组与A组OD比值表示Caspase-3活性。

2 结果

2.1 LPS对H9C2细胞miRNA-21表达的影响 LPS处理0、6、12 h时，H9C2细胞miRNA-21相对表达量分别为1.05±0.03、12.95±0.08、19.62±0.12；与0 h时比较，6、12 h时H9C2细胞miRNA-21相对表达量均升高(P均<0.01)。

2.2 抑制miRNA-21表达对LPS诱导H9C2细胞增殖的影响 A、B、C、D组H9C2细胞增殖的OD值分别为1.08±0.03、0.71±0.03、0.70±0.01、0.85±0.02，A组﹥D组﹥B、C组，P均﹤0.01。

2.3 抑制miRNA-21表达对LPS诱导H9C2细胞Bax、Bcl-2表达的影响 结果显示，LPS能够显著上调Bax表达，并下调 Bcl-2表达；miRNA-21抑制剂显著下调Bax表达，并上调Bcl-2表达。见表1。

表1 各组H9C2细胞Bax、Bcl-2蛋白 相对表达量比较±s)

注：与A组比较，*P均﹤0.01；与D组比较，#P均﹤0.01。

2.4 抑制miRNA-21表达对LPS诱导H9C2细胞Caspase-3活性的影响 结果显示，B、C、D组H9C2细胞Caspase-3活性分别为1.13±0.08、1.10±0.14、0.57±0.06,D组H9C2细胞Caspase-3活性性低于B、C组，P均﹤0.01。

3 讨论

在重症监护室中，心肌损伤目前已经成为脓毒血症死亡的最主要原因[10]。在脓毒症发生过程中，LPS被公认是一种致病因子。在LPS引起的心肌损害中，主要表现为细胞坏死和细胞凋亡两种形式。其中，细胞凋亡发生较早，是早期心肌细胞损伤的主要形式；抑制心肌细胞凋亡，将有助于改善心肌损害、恢复心脏功能[11]。

miRNA参与人类细胞30%～40%基因表达的调节，其可与靶基因mRNA互补结合，通过促进目的基因mRNA降解或抑制其翻译而负性调节靶基因表达，是基因表达调控的一个重要环节[12]。近期研究显示，miRNA-21在多种缺血缺氧性心血管疾病(如冠心病、心肌梗死等)中表达异常，并在疾病发生发展中发挥重要作用[9]。目前，miRNA-21被认为是一种能发挥抗凋亡作用的miRNA，在多种肿瘤细胞及过氧化氢所致心肌细胞氧化损伤中均表现出明显的抗凋亡效应[6, 13]。Cheng等[8]在缺血再灌注细胞模型中证实，降低miRNA-21表达水平可减少心肌细胞凋亡。本研究对体外培养的心肌细胞H9C2给予LPS刺激，结果显示刺激6、24 h时细胞miRNA-21表达均明显上升，提示miRNA-21可能参与脓毒血症所致的心肌细胞损害过程。

细胞凋亡是基因控制的细胞自主性死亡过程，它是在基因调控下的一个严密完整的程序过程。其中，Caspase家族在凋亡过程中起到非常重要的作用，是细胞形态学和生物学改变的关键执行者[14]。在本实验中，LPS刺激24 h后心肌细胞增殖能力降低，预先转染miRNA-21抑制剂可明显提高细胞增殖活性。Western blot法检测结果显示， LPS刺激24 h后心肌细胞凋亡蛋白Bax表达升高，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达下降；预先转染miRNA-21较LPS刺激组及阴性对照组可使凋亡蛋白Bax表达显著下降，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达显著上升。Caspase-3的活性实验亦证明如此，进一步说明miRNA-21参与LPS所致心肌细胞损害过程。其机制可能是通过转染miRNA- 21抑制剂降低miRNA-21水平，从而抑制LPS所致的细胞凋亡，从而增加细胞增殖活力。

本研究加深了对LPS所致心肌细胞损伤机制的了解，然而，miRNA-21作为重要的调节因子，在机体严重脓毒血症心肌损害中是否发挥保护作用，仍有待进一步深入探索。

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上海交通大学医学院课题项目(JY2011A10)；上海市长宁区卫生局资助项目(20104Y01001)。

姜虹(E-mail: 17897562@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.009

R459.7

A

1002-266X(2016)38-0029-03

2016-05-18)