PRMT1结合并增强HMGCR活性对食管鳞癌细胞增殖能力的影响

侯广杰，何苡，杨光煜

(河南省人民医院，郑州450003)



PRMT1结合并增强HMGCR活性对食管鳞癌细胞增殖能力的影响

侯广杰1，何苡1，杨光煜1

(河南省人民医院，郑州450003)

目的 探讨蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)结合羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)后活性变化及其对食管鳞癌细胞增殖能力的影响。方法 以食管鳞癌ECA109细胞为模型，通过免疫共沉淀法观察PRMT1与HMGCR在细胞中的相互结合作用。将ECA109细胞随机分为感染组和对照组，分别以表达特异性针对PRMT1的RNA干扰分子的慢病毒质粒转染48 h，采用Western blot法分别检测PRMT1、HMGCR蛋白及甲基化HMGCR蛋白，分光光度法检测HMGCR酶活性，CCK-8法检测细胞增殖活性。结果 细胞裂解后的蛋白共沉淀复合物分别用抗PRMT1、HMGCR抗体捕获后，可检测到HMGCR、PRMT1蛋白条带。感染组和对照组ECA109细胞中PRMT1蛋白相对表达量分别为0.057±0.011和0.239±0.041(P<0.01)，HMGCR蛋白相对表达量分别为0.175±0.031和0.184±0.037(P>0.05)。感染组和对照组 ECA109细胞甲基化HMGCR蛋白相对表达量分别为0.028±0.006、0.107±0.016，HMGCR相对活性分别为0.104±0.009、0.277±0.013，P均<0.01。感染组ECA109细胞培养24 h后，细胞增殖的OD450值已低于对照组(P<0.05)；培养48 h及72 h后，两组OD450值差距进一步扩大(P均<0.01)。结论 PRMT1可通过结合HMGCR蛋白促进其甲基化途径增强HMGCR蛋白活性，进而促进食管鳞癌细胞的体外增殖能力。

食管鳞癌；蛋白质精氨酸甲基转移酶1；羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶；细胞增殖

精氨酸甲基化是一种常见的蛋白翻译后修饰过程，在蛋白的活性调控过程中发挥重要作用。蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)作为一种重要的精氨酸甲基化修饰酶，在PRMT家族中催化活性最高，并广泛参与了细胞的增殖、凋亡、分化及代谢等各种生理过程[1,2]。越来越多的证据显示，PRMT1在肿瘤、心血管疾病等多种严重威胁人类健康及生命的重大疾病发生、发展过程中具有重要调控作用[3]。已有报道显示，PRMT1异常表达与乳腺癌、白血病、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、神经胶质瘤以及结肠癌等多种肿瘤的发生发展密切相关[3]。Singh等[4]研究发现,PRMT1高表达是食管鳞癌致病的独立危险因素。后续的临床调查发现，PRMT1在食管鳞癌组织中的表达水平较对应癌旁组织显著升高，细胞实验同样证实PRMT1具有促进食管鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及转移致瘤的作用[5,6]。但迄今为止，对PRMT1调控食管鳞癌细胞生物学活性的具体分子机制仍不明确。2013年6月～2015年5月，我们采用免疫共沉淀检测PRMT1与调控细胞内甲羟戊酸途径的关键限速酶羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)的结合情况，进而观察PRMT1低表达对HMGCR蛋白表达、甲基化水平、酶活性以及食管鳞癌细胞增殖能力的影响，从而探讨PRMT1调控食管鳞癌细胞增殖的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 食管鳞癌细胞株ECA109购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；DMEM、FBS购自Invitrogen公司；表达特异性针对PRMT1的RNA干扰分子的慢病毒质粒由上海和元生物生物技术有限公司构建，干扰位点序列为5′-GACTTCACCATCGACCTGGACTTCA-3′；小鼠/兔抗人PRMT1抗体、小鼠/兔抗人HMGCR抗体、小鼠抗甲基化精氨酸抗体以及HRP标记的山羊抗小鼠二抗购自Santa Cruz公司;Protein A琼脂糖珠购自Amersham公司;PVDF膜购自Millipore公司；HMG-CoA、NADPH购自Sigma公司;CCK-8试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 PRMT1与HMGCR相互作用观察 采用免疫共沉淀法。常规胰酶消化法收集1×107个 ECA109细胞，加入1 mL细胞裂解液(50 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl，0.5% NP-40，10 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT，1 mg/mL抑肽酶)裂解细胞；将裂解液于4 ℃下15 000 r/min离心30 min，留取20 μL上清作为Input对照。裂解上清液中加相应1 μg 兔抗人PRMT1或HMGCR抗体，加入预处理的Protein A琼脂糖珠，4 ℃孵育过夜。随后4 ℃以3 000 r/min离心3 min，吸弃上清，琼脂糖珠用1 mL裂解缓冲液漂洗3次；加入20 μL 2×SDS上样缓冲液，沸水煮5 min后进行12% SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，采用半干转印法将凝胶中的蛋白转印至PVDF膜。PVDF膜采用5%的脱脂牛奶常温封闭2 h，加入TBST稀释相应小鼠抗人单克隆抗体(抗人PRMT1抗体进行共沉淀的样本加抗人HMGCR抗体、抗人HMGCR抗体进行共沉淀的样本加抗人PRMT1抗体)，4 ℃孵育过夜，取出后TBST洗膜3次。随后加入HRP标记山羊抗小鼠二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，增强型化学发光显影。

1.3 细胞培养与慢病毒感染 Eca109细胞采用DMEM(含10%胎牛血清)培养基，于5% CO2、37 ℃条件下培养。取对数生长期的ECA109细胞接种于96孔板，随机分为感染组和对照组，于细胞融合80%时分别以重组慢病毒质粒LV.PRMT1-shRNA、空病毒质粒LV.NULL转染48 h。

1.4 PRMT1和HMGCR蛋白检测 采用Western blot法。常规胰酶消化法收集两组细胞，加入细胞裂解液(组成同1.2)裂解细胞；提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度。各取20 μg总蛋白进行12% SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，转膜方法同1.2。加入TBST稀释相应小鼠抗人单克隆抗体(抗人PRMT1、HMGCR及β-actin抗体)，4 ℃孵育过夜，取出后TBST洗膜3次。随后加入HRP标记山羊抗小鼠二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，增强型化学发光显影。采用图像分析软件扫描条带，以PRMT1及HMGCR蛋白与β-actin光密度(OD)比值表示其相对表达量。

1.5 HMGCR甲基化水平检测 采用Western blot法。常规胰酶消化法收集两组细胞，加入细胞裂解液裂解细胞，于4 ℃下15 000 r/min离心30 min取上清。裂解上清液加相应1 μg兔抗人HMGCR抗体，加入预处理的Protein A琼脂糖珠，4 ℃孵育过夜。随后4 ℃下以3 000 r/min离心3 min，小心吸弃上清，琼脂糖珠用1 mL裂解缓冲液漂洗3次；加入20 μL 2×SDS上样缓冲液，沸水煮5 min，上样转膜方法同1.2。加入TBST稀释小鼠抗甲基化精氨酸抗体，4 ℃孵育过夜，取出后TBST洗膜3次。随后加入HRP标记山羊抗小鼠二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，增强型化学发光显影。采用图像分析软件进行条带光密度扫描，以甲基化HMGCR蛋白与β-actin光密度比值表示的HMGCR蛋白甲基化程度。

1.6 HMGCR酶活性观察 采用分光光度法。常规胰酶消化法收集细胞，加入细胞裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度。取细胞裂解液20 μL，加入180 μL反应液(100 mmol/L KCl，100 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L 巯基乙醇，1 mmol/L HMG-CoA，1 mmol/L NADPH)，25 ℃孵育1 min及5 min；采用图像分析软件检测OD340值，按照公式计算HMGCR相对活性。E=ΔOD340/Δt。

1.7 细胞增殖情况观察 采用CCK-8法。取两组细胞，以5×102/孔接种96孔板。培养0、24、48、72 h后，每孔加入CCK-8反应液10 μL，37 ℃孵育1 h，采用图像分析软件检测OD450值，以其表示细胞增殖情况。

2 结果

2.1 ECA109细胞中PRMT1与HMGCR蛋白的相互作用 结果显示，细胞裂解后的蛋白共沉淀复合物用抗PRMT1抗体捕获后，可检测到HMGCR蛋白条带；同样，细胞裂解后的蛋白共沉淀复合物用抗HMGCR抗体捕获后，可检测到PRMT1蛋白条带。这表明PRMT1与HMGCR在ECA109细胞内相互结合。

2.2 抑制PRMT1表达对ECA109细胞PRMT1、HMGCR蛋白表达的影响 感染组和对照组ECA109细胞中PRMT1蛋白相对表达量分别为0.057±0.011和0.239±0.041(P<0.01)，感染组HMGCR蛋白表达水平降至对照组的23.8%。感染组和对照组ECA109细胞中HMGCR蛋白相对表达量分别为0.175±0.031和0.184±0.037，两组间HMGCR蛋白表达水平无统计学差异。

2.3 抑制PRMT1表达对ECA109细胞HMGCR甲基化水平及酶活性的影响 感染组和对照组 ECA109细胞甲基化HMGCR蛋白相对表达量分别为0.028±0.006和0.107±0.016，感染组HMGCR蛋白甲基化水平低于对照组(P<0.01)。感染组、对照组ECA109细胞HMGCR相对活性分别为0.104±0.009、0.277±0.013，感染组HMGCR相对活性低于对照组(P<0.01)。

2.4 抑制PRMT1表达对ECA109细胞增殖活性的影响 感染组ECA109细胞培养24 h后，细胞增殖活性已低于对照组(P<0.05)，培养48 h及72 h后，两组差异进一步扩大(P均<0.01)。见表1。

表1 两组ECA109细胞增殖的OD450值比较

注：与对照组同时点比较，*P<0.05，#P<0.01。

3 讨论

蛋白质的转录后修饰是生物体内普遍存在的现象，包括磷酸化、乙酰化、泛素化等多种蛋白质转录后修饰方式[7]。蛋白质的甲基化是一种重要的真核细胞翻译后修饰，参与了细胞信号转导、RNA加工和运输、DNA转录、蛋白之间的相互作用等生物学事件[1,2]。蛋白甲基化的对象主要为赖氨酸和精氨酸残基，关于赖氨酸甲基化的研究开展的较早，近年来针对精氨酸甲基化的研究正在逐步深入[1,2]。

催化精氨酸甲基化的酶称为PRMT，它们以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，可以催化转运1～2个甲基基团到目的蛋白精氨酸残基的胍基氮分子。根据其产物的不同，PRMT可分为4种类型。PRMT1基因位于染色体19q13.3上，是PRMT家族中Ⅰ型成员[1,2]。PRMT1识别靶蛋白中特定的短肽序列(RHR、RVR、RGG、GAR、GRG等)，并催化其中的精氨酸残基发生甲基化[8～11]。PRMT1作为一种重要的蛋白甲基化修饰酶，在PRMT家族中催化活性最高，并广泛参与细胞的增殖、凋亡、分化及代谢等各种生理过程[1,2]。Yu等[12]发现，敲除PRMT1基因后小鼠胚胎发育约6.5 d时即死亡，提示PRMT1在哺乳动物发育过程中发挥着不可替代的重要作用。近期，有关PRMT1调控肿瘤发生发展的研究取得了令人鼓舞的进展。大量研究发现，PRMT1在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌等多种肿瘤组织中高表达，且PRMT1表达水平与肿瘤发生、发展及侵袭转移过程密切相关[3]。

近来，Singh等[4]发现PRMT1高表达是食管鳞癌致病的独立风险因素，Zhou等[5,6]发现PRMT1在食管鳞癌组织中的表达水平显著升高，后续的细胞和动物模型实验证实了PRMT1具有促进食管鳞癌细胞增殖迁移以及致瘤的作用。在本研究中，我们通过慢病毒介导的RNA干扰质粒抑制食管鳞癌细胞中PRMT1表达，发现抑制PRMT1表达可显著下调食管鳞癌细胞的增殖活性，该结果同样提示PRMT1在食管鳞癌细胞增殖调控过程中发挥重要作用。

为了更深入地了解PRMT1调控食管鳞癌细胞增殖的分子机制，我们对可能与调控食管鳞癌细胞增殖相关的PRMT1潜在靶基因进行了初步的筛选。免疫共沉淀结果显示，HMGCR在食管鳞癌细胞中与PRMT1相互结合。HMGCR是一种以NAD+或NADP+为受体、作用于供体CH-OH基团上的氧化还原酶[13]。研究证实，HMGCR是细胞内甲羟戊酸代谢途径中的限速酶[13]，被广泛作为降胆固醇药的作用靶点，用于抑制细胞内甲羟戊酸途径的活性。近年来，大量的研究显示，肿瘤细胞内甲羟戊酸途径的代谢水平较正常细胞显著增强[14]。此外，体外细胞学实验研究显示，上调甲羟戊酸途径代谢水平可增强肿瘤细胞的增殖能力；反之，抑制甲羟戊酸途径代谢水平则可抑制肿瘤细胞增殖能力[15,16]。据此业内专家广泛认为，甲羟戊酸途径的激活是促进肿瘤细胞增殖的重要因素。鉴于上述原因，近年来有学者提出了通过抑制胞内HMGCR活性以遏制肿瘤生长的设想并进行了初步的探索[14,17]。鉴于现有常见的HMGCR抑制剂如他汀类药物靶向性差[14]并可导致严重不良反应[18]等不足，因此探索调控胞内HMGCR表达及活性的分子机制并开展相应的生物靶向性治疗成为该领域的研究热点之一。

在本研究中，我们抑制食管鳞癌细胞PRMT1表达后发现HMGCR蛋白表达水平未发生显著变化。但值得注意的是，抑制PRMT1表达可导致胞内HMGCR甲基化水平显著降低，同时HMGCR酶活性显著下降。鉴于我们发现PRMT1与HMGCR在食管鳞癌细胞内能够相互结合，因此我们认为PRMT1结合HMGCR后可对HMGCR进行甲基化修饰，进而增强其酶活性。初步的序列分析结果显示，人HMGCR蛋白701～703位点存在GRG序列，且该部分序列在哺乳动物中保守，提示702位精氨酸残基是PRMT1催化HMGCR甲基化的一个潜在位点。在后续实验中我们将对此进行验证，以期进一步明确PRMT1通过催化HMGCR甲基化调控其酶活性，进而调控食管鳞癌细胞增殖活性的具体分子机制，从而为食管鳞癌的基因治疗提供新的靶点。

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Effects of PRMT1 interacting with HMGCR and regulating its activity on proliferative capacity of esophageal squamous cell carcinoma cells

HOUGuangjie1,HEYi,YANGGuangyu

(1HenanProvincePeople'sHospital,Zhengzhou450003,China)

Objective To investigate the effect of protein arginie methyltransferase 1 (PRMT1) interacting with HMG-CoA reductase (HMGCR) and regulating its activity on the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) cells. Methods Human esophageal cancer ECA109 cells were chosen as the cell models. The interaction between PRMT1 and HMGCR was detected by co-immunoprecipitation. ECA109 cells were randomly divided into two groups: the infection group and the control group. ECA109 cells were infected with lentivirus expressing small hairpin RNA of HMGCR for 48 h. Then, the relative expression level of PRMT1, total and methylated HMGCR protein was detected by Western blotting. The relative activity of HMGCR was detected by ultraviolet spectrophotometry. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay. Results In the infection group and control group, the protein expression of PRMT1 in ECA109 cells of was 0.057±0.011 and 0.239±0.041, respectively (P<0.01), and the protein expression of HMGCR was 0.175±0.031 and 0.184±0.037 (P>0.05). In ECA109 cells of the infection group and control group, the protein expression of methylated HMGCR was 0.028±0.006 and 0.107±0.016, and the relative activity was 0.104±0.009 and 0.277±0.013, respectively, (allP<0.01). The OD45of ECA109 cells after 24-hour culture in the infection group was significantly lower than that of control group (P<0.05), and after 48 h and 72 h, the difference between these two groups further expanded (allP<0.01).Conclusion PRMT1 increases the proliferative capacity of ESCC cells by interacting with HMGCR and regulating its activity.

esophageal squamous carcinoma; protein arginie methyltransferase 1; HMG-CoA reductase; cell proliferation

河南省科技攻关计划项目(122102310618)。

侯广杰(1973-)，博士，副主任医师，主要研究方向为肿瘤的微创治疗。E-mail: guangjiehou@hotmail.com

简介：杨光煜(1964-)，男，主任医师，主要研究方向为食管癌的精准治疗。E-mail: hnsyygy@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.006

R735.1

A

1002-266X(2016)38-0019-04

2016-07-12)