甘蔗糖厂成糖工序生产线样品中部分细菌菌株的鉴定

游彪，毛瑞丰*，许鸣锐，江燎莹，刘雅楠，黄结

（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530000）

甘蔗糖厂成糖工序生产线样品中部分细菌菌株的鉴定

游彪，毛瑞丰*，许鸣锐，江燎莹，刘雅楠，黄结

（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530000）

通过16S rRNA序列分析，结合微生物的形态学观察、生理生化试验对甘蔗糖厂成糖工序生产线检出的部分细菌进行了分离鉴定。结果显示，从甘蔗糖生产线样品中获得常见的4株菌，菌株S-1鉴定为克氏库克菌(Kocuria kristinae)、菌株S-2为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、菌株S-3为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、菌株S-4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。因此，糖厂应该加强微生物污染源和污染途径的监控，以此保证甘蔗糖品质。

甘蔗糖；鉴定；克氏库克菌；蜡样芽胞杆菌；解淀粉芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌

甘蔗糖作为甜味剂已经有很长的历史了，除此之外它还能够改变食品的风味、色泽和质地[1]，是一种天然的食品添加剂。由于其具有丰富的营养成分[2]，加上粗放的生产工艺，因此在压榨时常常受到明串球菌属（Leuconostoc sp.）[3-4]的污染，而在成品糖中极易受到嗜温细菌、嗜热细菌和嗜热产芽孢菌[1]以及霉菌[5]的污染。

成品糖中的微生物极有可能来自上游工序—成糖工序，作为唯一的洁净区，它依次包括落糖口、一级振筛、二级振筛、三级振筛、流化床、四级振筛，该工段也是糖厂进行微生物控制的关键工序，但是它完全暴漏在空气中且非常容易积垢。李扬[5]在成糖工序曾对其中的霉菌做过相关的研究，结果发现成糖工序检出的菌株与成品糖中的菌株具有相关性。目前对甘蔗糖成糖工序的细菌种属研究较少，在食品行业中还没有意识到甘蔗糖中的细菌会对食品生产、贮藏以及消费者的健康带来多大的影响。因此，本研究立足于成品糖成糖工序的四级振筛这一关键控制点，研究该点的细菌种类，为以后的研究做好铺垫。

由于16S rRNA序列分析检测技术具有时间短、灵敏度高、特异性强以及不依赖微生物的纯培养技术的特点[6]，被广泛运用于食品[7-8]、药品[9]、临床[10]中细菌种类的鉴定。本研究借助16S rRNA序列分析方法，对成糖工序四级振筛上物料中的细菌进行分类鉴定，并构建系统发育进化树，以期为甘蔗糖中的微生物控制提供依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1样品

甘蔗糖样品：广西壮族自治区某糖厂。

1.1.2培养基

胰蛋白胨大豆肉汤（trypticase soy broth，TSB）培养基：胰酶水解的酪素17.0 g/L，胃酶水解的大豆3.0 g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，一水葡萄糖2.5 g/L，琼脂20 g/L，pH值7.3±0.2（25℃），121℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.1.3试剂

结晶紫、孔雀绿、碘单质、体积分数95%乙醇溶液、葡萄糖、亚硝酸盐（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

细菌脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒、PremixTaqTM：宝生物工程（大连）有限公司；27F/1492R通用引物：北京六合华大基因科技股份有限公司；Biowest Regular Agarose G-10：基因科技（上海）股份有限公司；4S Red Plus核酸染色剂：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2仪器与设备

SH11/YF-9光学显微镜：桂林市迈特光学仪器有限公司；5430R高速小型离心机：德国Eppendorf公司；Mini-Sub Cell GT Cell电泳槽、164-5050 Powerpac Basic电泳仪、CHEMIDOC XRS免染电泳成像系统：美国Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1菌株的分离纯化

在无菌条件下称量1 g四级振筛上的物料，置于已灭菌的平板中，取15 mL倒入已经灭菌冷却至50℃的TSB培养基中，轻轻摇动平板，混合均匀，平放于无菌操作台上，冷却后倒置于37℃恒温箱中培养2 d。待培养基中长满菌落后，从平板中挑取单菌落于TSB培养基中划线，37℃培养2 d，重复进行上述划线操作，直到获得纯化的菌株为止。

1.3.2菌株生理生化试验

对所得纯化菌株进行生理生化鉴定，试验操作参见《常见细菌鉴定手册》[11]。

1.3.316S rRNA基因序列分析

利用细菌基因组DNA提取试剂盒对菌株进行基因组DNA的提取，方法步骤详见试剂盒说明书。利用通用引物27F/1492R对基因组进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，PCR反应体系见表1。反应条件为：98℃变性10 s，55℃退火30 s，27次循环，72℃延伸96 s，得到16S rRNA基因片段，经过1%琼脂糖凝胶电泳，条带明亮的样品送至华大基因（深圳）测序。测序结果通过美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行比对，从而确定与数据库中序列相似性。并且利用MEGA 6中的邻接法（neighbour-joining，NJ）构建系统发育树。

表1　PCR反应液的组成Table 1　Composition of PCR reaction liquid

2　结果与分析

2.1菌株形态特征

经过分离纯化后，从四级振筛物料中得到菌株根据菌落特征和细胞形态特征，初步将分离菌株划分为两类：L-1、L-2，常见的4株菌株为S-1、S-2、S-3、S-4。

表2　分离菌株的细胞和菌落形态特征Table 2　Cell and colony morphological characteristics of isolated strains

经过上述初步的形态学鉴定，本试验又对这两类菌株进行了革兰氏染色、芽孢染色、运动性测定，结果见表2。由表2可知，分离菌株均为革兰氏阳性菌株（G+），L-1类中的菌株不具有运动性，而L-2类的菌株都具有运动性，且具有芽孢。因此，通过上述的形态学鉴定后，对分离纯化过程中常见的4株菌S-1、S-2、S-3、S-4进行生理生化试验。

2.2生理生化结果

分离菌株S-1、S-2、S-3、S-4、S-5的生理生化试验结果见表3。

表3　分离菌株生理生化试验结果Table 3　Results of physiological biochemical tests of isolated strains

由表3可知，参照《常见细菌鉴定手册》初步鉴定菌株S-1为微球菌属（Micrococcus）；菌株S-2、S-3、S-4为芽孢杆菌属（Baciilus）。

2.316S rRNA序列分析与系统发育树的构建

通过1%琼脂糖凝胶电泳检测16S rRNA扩增电泳产物，PCR扩增产物电泳图见图1。

由图1可知，分离菌株的16S rRNA PCR扩增产物的分子质量在1 000～2 000 bp之间。将分离菌株的16S rRNA序列测序结果与NCBI数据库中已报道的模式菌株序列进行比对，每种菌株列举了3株近缘菌株，结果见表4。

图1　分离菌株的16S rRNA PCR扩增产物电泳图Fig.1　PCR amplification product electrophoretogram of 16S rRNA of isolated strains

表4　4株细菌的16S rRNA序列比对结果Table 4　Comparison results of 16S rRNA sequence of four strains of bacteria

由表4可知，菌株S-1与模式菌株克氏库克菌（Kocuria kristinae）序列匹配率达到了98%；菌株S-2与模式菌株蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）序列匹配率达到了98%；菌株S-3与模式菌株解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）序列匹配率达到了99%；菌株S-4与模式菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）序列匹配率也达到了99%。

采用MEGA 6软件中的邻接法构建系统发育树，结果见图2～图5。

图2　菌株S-1基于16S rRNA序列建立的系统发育树Fig.2　Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain S-1

图3　菌株S-2基于16S rRNA序列建立的系统发育树Fig.3　Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain S-2

图4　菌株S-3基于16S rRNA序列建立的系统发育树Fig.4　Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain S-3

图5　菌株S-4基于16S rRNA序列系统发育树Fig.5　Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain S-4

由系统发育树的构建结果可知，菌株S-1、S-2、S-3、S-4分别鉴定为克氏库克菌（Kocuria kristinae）、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

3　结论

本研究对甘蔗糖厂成糖工序四级振筛物料中的部分细菌菌株进行分离鉴定，通过形态学、生理生化试验、16S rRNA序列分析，分离菌株S-1、S-2、S-3、S-4分别鉴定为克氏库克菌（Kocuria kristinae）、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

通过对检出菌株的文献检索，本研究发现试验中的四级振筛存在着可以致病的菌株：克氏库克菌（Kocuria kristinae）[15]和蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）[16]，表明甘蔗糖有可能引起食源性疾病；产芽孢细菌的耐受性强，这将会对下游的食品加工中微生物的控制造成较大地影响。因此，在甘蔗糖的过程生产中有必要加强对细菌菌株的检测和控制。

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Identification of some bacteria strains from samples in sugar process production line of sucrose factory

YOU Biao,MAO Ruifeng*,XU Mingrui,JIANG Liaoying,LIU Yanan,HUANG Jie
(College of Light Industry and Food Engineering,Guangxi University,Guangxi Nanning 530000)

Some bacteria strains from samples in sugar process production line of sucrose sugar factory were isolated and identified by 16S rRNA sequence analysis,morphology observation and physiological biochemical tests.The results showed four strains of common bacteria were obtained from samples of sucrose sugar production lines.Strain S-1,S-2,S-3 and S-4 were identified asKocuria kristinae,Bacillus cereus,Bacillus amyloliquefaciensandBacillus subtilis,respectively.Therefore,sugar factory should strengthen the strengthen monitoring of microbial pollution source and pollution approach.

sucrose sugar;identification;Kocuria kristinae;Bacillus cereus;Bacillus amyloliquefaciens;Bacillus subtilis

TS207

0254-5071（2016）10-0126-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.028

2016-03-10

游彪（1991-），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物。

毛瑞丰（1963-），男，副教授，博士，研究方向为食品微生物。