河南省2008-2014年5岁以下腹泻儿童A组轮状病毒病原学及流行病学特征研究

赵嘉咏，张白帆，申晓靖，夏胜利，黄学勇，许汴利



河南省2008-2014年5岁以下腹泻儿童A组轮状病毒病原学及流行病学特征研究

赵嘉咏，张白帆，申晓靖，夏胜利，黄学勇，许汴利

目的 分析2008-2014年河南省5岁以下腹泻儿童A组轮状病毒的感染状况及流行病学特征。方法 采集河南省两个监测哨点医院5岁以下儿童腹泻病例的粪便样本2 098份，双抗体夹心法ELISA检测A组轮状病毒，阳性样本抽提病毒RNA，两步巢式多重RT-PCR进行G-P基因分型，同时收集病例临床与流行病学信息进行分析。结果 2 098份腹泻样本共检出A组轮状病毒688份，总阳性率32.8%。年检出率最高46.4%(2013年)，最低26.7%(2009年)。轮状病毒检出率的季节性特征显著，存在秋季和春季两个高峰。A组轮状病毒型别组合以G9P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G1P[8]为主，还存在部分混合感染型别。感染病例集中于4个月到1岁，以无临床症状或轻症为主。结论 河南省5岁以下腹泻患儿中存在较高的A组轮状病毒感染率，病原体可分为多种基因型别，感染人群具有显著的流行病学特征。

A组轮状病毒；儿童；基因分型；流行特征

人感染A组轮状病毒(Human Rotavirus A，简称HRVA)是引起5岁以下儿童秋季腹泻的主要病原体之一，其通过感染小肠粘膜上皮细胞，造成细胞损伤，引起渗透性(水性)腹泻病。A组轮状病毒在每年的秋冬季流行，感染途径为粪-口途径，临床表现为急性胃肠炎，可导致发热、呕吐、腹泻及脱水等严重并发症[1-2]。本研究对河南省2008-2014年采集自5岁以下儿童腹泻粪便中的A组轮状病毒进行病原学检测与基因型别分析，为其疾病监测、防控策略制定、爆发疫情调查及疫苗研发提供基线数据与科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例定义 依据中国疾控中心《全国病毒性腹泻监测方案》制定的病毒性腹泻病例定义，对郑州市和开封市两家儿童医院5岁以下(1-59月龄)腹泻患儿，每日排便3次或3次以上，且大便性状有改变，呈稀便、水样便等；大便常规镜检WBC<15，未见RBC的病例进行腹泻样本采集。

1.1.2 样本采集与保存 粪便标本在患者发病3 d内或入院24 h内采集，固体便每份取5～10 g，水样便或稀便每份取5～10 mL，放入螺口采样盒中置于-20 ℃冻存，在检测前避免反复冻融。2008年196份，2009年292份，2010年238份，2011年354份，2012年332份，2013年375份，2014年311份，共计2098份。

1.1.3 主要试剂与仪器 双抗体夹心法ELISA检测试剂盒购自英国OXOID公司；磁珠法病毒核酸提取试剂盒购自西安天隆科技公司；SuperScriptⅢ逆转录酶购自美国invitrogen公司；dNTP MIX、GoTaq DNA聚合酶购自美国Promega公司；引物(HPLC纯化)由上海invitrogen合成；100 bp Marker购自大连宝生物生物技术公司；电泳琼脂糖购自西班牙Biowest公司；50×TAE电泳缓冲液购自北京Solarbio公司。自动核酸提取仪购自西安天隆科技公司；去离子水系统购自美国Milipore公司；Minispin台式离心机、PCR仪购自德国Eppendorf公司；核酸电泳及凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 样本抗原检测 粪便样本置于室温自然解冻，每人份取0.1 g固体粪便或100 μL液体粪便标本加入1.0 mL样品稀释液(试剂盒所配)至1.5 mL EP管中，置于漩涡震荡器振荡混匀(每次振荡30 s，振荡3次)，室温静置10 min， 8 000 r/min离心5 min后参照说明书取100 μL上清加入ELISA微孔板中，37 ℃孵育60 min，洗板3次，每孔加入100 μL四甲基联苯胺(TMP)显色液，室温静置15 min后加入终止液酶标仪读取OD450值并判定结果。

1.2.2 病毒RNA的提取及A组轮状病毒基因分型 取样本稀释液200 μL，使用磁珠法自动核酸提取仪(西安天隆NP968型)进行病毒总RNA提取。提取产物参照世卫组织轮状病毒参比实验室提供的A组轮状病毒G(病毒外壳蛋白VP7)/P(病毒外壳蛋白VP4)基因分型引物序列及试验方案进行，其中G分型包括G1/G2/G3/G4/G8/G9/G10/G11 8条引物，P分型包括P4/P6/P8/P9/P10/P11 6条引物。第一轮RT-PCR反应步骤及参数为：98 ℃变性5 min，冰内冷却退火5 min；42 ℃ 60 min，94 ℃ 3 min，(94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)×35个循环，72 ℃ 7 min，反应体积25 μL。第二轮巢式PCR取第一轮扩增产物2 μL作为模板，反应参数为：94 ℃ 3 min，(94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)×35个循环，72 ℃ 7 min，反应体积50 μL。

1.2.3 电泳与结果判断 取10 μL PCR扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳(140 V,30 min)。根据特异性核酸条带大小和数目组合判断A组轮状病毒基因类别。

2 结 果

2.1 A组轮状病毒ELISA检测结果 2 098份腹泻样本共检出A组轮状病毒688份，总阳性率32.8%。其中2008年阳性率29.1%(57/196)；2009年阳性率26.7%(78/292)；2010年阳性率37.8%(90/238)；2011年阳性率27.1%(96/354)；2012年阳性率32.2%(107/332)；2013年阳性率46.4%(174/375)；2014年阳性率27.7%(86/311)。分月份看，每年的10月份阳性率最高，7年的平均阳性率为53.9%；阳性率最低的是每年的7月份，7年的平均阳性率为4.0%。检出率的季节性变显著，存在秋季(9-11月份)和春季(3-5月份)两个较为显著的高峰(表1，图1)。

2.2 A组轮状病毒GP基因分型结果 688株A组轮状病毒G分型为G1、G2、G3、G4、G9；以G1、G2、G3、G9为主；P分型为P[4]、P[6]、P[8]、P[9]；以P[4]、P[8]为主。A组轮状病毒型别有G1P[8]，G2P[4]，G3P[8]，G4P[9]，G9P[4]，G9P[8]，以G9P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G1P[8]为主。另外经测序证实还存在混合感染的型别，有G13P[8]，G234P[8]，G39P[8]，G389P[6][8]，G9P[4][8]，G2P[4][10](表2，图2)。

表1 2008年-2014年河南省5岁以下腹泻患儿A组轮状病毒检测结果一览表
Tab.1 Detection of human rotavirus A in children with diarrhea under 5 years in Henan Province, 2008-2014

month2008200920102011201220132014positivestrains/samples/(%)positivestrains/samples/(%)positivestrains/samples/(%)positivestrains/samples/(%)positivestrains/samples/(%)positivestrains/samples/(%)positivestrains)/samples/(%)10/5/0.01/10/10.00/2/0.00/7/0.00/10/0.02/12/16.70/6/0.021/5/20.00/5/0.00/2/0.01/13/7.71/10/10.06/17/35.30/8/0.031/4/25.01/14/7.12/8/25.02/11/18.22/8/25.06/16/37.53/12/25.044/10/40.00/6/0.03/10/30.02/12/16.73/19/15.88/22/36.43/15/20.052/12/16.74/29/13.87/21/33.37/38/18.42/22/9.16/20/30.01/17/5.963/20/15.03/20/15.02/13/15.43/27/11.12/24/8.31/19/5.31/22/4.571/20/5.01/18/5.60/9/0.02/35/5.72/29/6.90/11/0.01/20/5.080/17/0.01/21/4.8%1/7/14.32/29/6.91/18/5.62/12/16.70/16/0.099/30/30.019/48/39.620/56/35.722/44/50.019/45/42.239/58/67.229/51/56.91017/41/41.518/60/30.044/77/57.128/41/68.351/81/63.069/109/63.342/78/53.81115/23/65.227/49/55.19/24/37.523/69/33.323/55/41.828/55/50.96/60/10.0124/9/44.43/12/25.02/9/22.24/28/14.31/11/9.17/24/29.20/6/0.0总计57/196/29.178/292/26.790/238/37.896/354/27.1107/332/32.2174/375/46.486/311/27.7

表2 2008-2014年河南省A组轮状病毒G/P基因分型结果一览表
Tab.2 The G/P genotyping result of rotavirus A in Henan Province from 2008 to 2014

GenotypeYearRatio2008200920102011201220132014Total(%)G9P[8]1173646611215333548.7G3P[8]30312723149814220.6G2P[4]59611817147010.2G1P[8]1714138111268111.8G9P[4]010016081.2G39P[8]000104271.0G2P[4][10]112031081.2G9P[4][8]0233131131.9G4P[9]000120140.6G13P[8]000021140.6G1P[+]3333200142.0G234P[8]000010010.1G389P[6][8]000010010.1总计Total5778909610717486688100.0

注：P[+]为P未分型；G13P[8]、G389P[6][8]等表示G和(或)P型别的混合感染

图1 2008-2014年河南省5岁以下腹泻患儿A组轮状病毒检出率月分布Fig.1 Detection rate trend of rotavirus A in children under 5 years in Henan Province from 2008 to 2014

2.3 A组轮状病毒感染病例流行病学资料分析 688例A组轮状病毒感染病例中，男女性别比1.2∶1(377∶311)；城市阳性率23.7%(219/926)，农村阳性率40.0%(469/1 172)，农村显著高于城市；阳性病例以4-12个月龄婴幼儿为主；临床上存在不同程度的发热、呕吐、腹泻、脱水等症状。病例年龄及临床体征分布见表3。

M: 100 bp DNA marker；1，2，5，6，8，9，11，13，16：G9P[8]；3，7，12，14：G2P[4]；4，15：G9P[4][8]；10: G2P[4][10]；The upper half of the map is G genotyping and the lower part is P genotyping.图2 A组轮状病毒G/P分型 PCR结果凝胶电泳图谱(部分)Fig.2 The gel electrophoresis map of rotavirus A G/P genotyping results (partly)

表3 A组轮状病毒阳性病例年龄与临床症状统计表
Tab.3 Statistics of age and clinical symptoms of group A rotavirus positive cases

agecase/(%)temperature,(℃)case/(%)diarrheatimescase/(%)vomitingtimescase/(%)dehydration(%)case/(%)0-3months78/11.3<37539/78.30-3199/28.90594/86.30589/86.34-6months187/27.237-37.5102/14.84-6369/53.61-275/10.91-591/13.27-12months189/27.537.6-3821/3.17-979/11.53-412/1.7>58/1.21-2yrs73/10.6>3826/3.810-1541/6.0>47/1.02-3yrs40/5.83-4yrs88/12.84-5yrs33/4.8

3 讨 论

轮状病毒(Human rotavirus, HRV)是病毒性腹泻的主要病原体，根据HRV内壳蛋白VP6抗原将HRV分为A-G 7个组，其中A、B、C 3组可以感染人[3]。A组轮状病毒为较为少见的双链RNA病毒，颗粒直径70 nm，二十面体对称，是5岁以下儿童感染性重症胃肠炎(腹泻)的主要病原，也是导致婴幼儿腹泻和死亡的重要疾病之一，占腹泻住院儿童的比例超过40%。根据世界卫生组织估算，全球范围内每年大约引起61.1万婴儿和儿童死亡，特别是在非洲，亚洲及南美洲等发展中国家[4-5]。轮状病毒感染属于自限性疾病，由于常规的卫生和消毒措施对阻止病毒感染的效果并不明显，接种疫苗成为了当前世界范围内预防该病的主要医疗手段。WHO在2009年已建议把轮状病毒疫苗接种列入所有国家的免疫规划中[6]。由于A组轮状病毒抗原型别的复杂性、多样性及变异性，持续开展其病原学监测，掌握其感染状况及基因型别的分布和变异趋势对于开展疾病负担调查，制定防控策略能够提供重要的基线数据，同时为疫苗研发和改进也提供了最关键的参考依据。

A组轮状病毒核衣壳蛋白可分为外壳蛋白和内壳蛋白，外壳蛋白以VP4和VP7为主，是A组轮状病毒主要的抗原决定子，其所对应核酸序列是进行G/P基因分型的依据。全球不同地区流行病学调查表明，不同的时间、不同的地区其流行株有较大差异。Gl、G2、G3、G4以及P[4]、P[6]、P[8]是世界范围内包括中国最常见的优势型，直到上世纪90年代中叶，最常见的四种组合依然为G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]和G4P[6][7-8]。近年来，HRVA又呈现新的分子流行病学特点，G9型呈快速上升趋势，G9P[8]型别已成为第5种新的流行型别[9]。从本研究看，河南省HRVA的基因型别以G9P[8]、G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]为主，这和目前世界范围的HRVA的病原学特征和流行趋势是一致的。从河南省的历史监测数据看，G9P[8]是型别占比上升最为迅速的型别，其从2008年的1.8%上升至2014年的61.6%，已成为河南省5岁以下儿童HRVA感染的主要型别。另外河南省HRVA病原学的另一个特点就是存在混合感染型别，由于HRVA的易感性、抗原多样性及机体感染后免疫力难以持久和交叉免疫保护力弱等特点，5岁以下儿童感染率可接近100%，且易形成不同型别的反复感染，因此在同一病人体内检测出多种型别的混合感染是可以解释的。

从阳性病例的流行病学资料来看，河南省HRVA感染的男性多于女性，年龄分布以4个月到1岁为主，2到5岁间感染率呈下降趋势。农村感染率显著高于城市，这与河南省细菌性腹泻感染率的城乡差别一致。临床症状主要是以轻症腹泻为主，少量病人伴有发热、呕吐、脱水等症状，体现了轮状病毒致病力、毒力较弱的特点。从检出率的时间变化趋势看，河南省的HRVA感染除了具有“秋季腹泻”的季节性特点外，在春季也存在一个小高峰。研究表明，HRVA的环境存活状况与温度和湿度密切相关[10]，河南省作为中部偏北地区，春季和秋冬季大气环境方面近似，温度与湿度相差不大，客观上为HRVA的繁殖和传播提供了一个相对适宜的环境，也是春季检出率偏高的主要原因之一。

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Etiologic and epidemiological research of rotavirus group A in children with diarrhoea under five years in Henan Province from 2008 to 2014

ZHAO Jia-yong, ZHANG Bai-fan, SHEN Xiao-jing, XIA Sheng-li, HUANG Xue-yong, XU Bian-li

(InstituteforInfectiousDiseaseControlandPrevention,HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016,China)

To investigate the infectious status and epidemiological characteristics of group A rotavirus from children under five years old from 2008 to 2014 in Henan Province, stool samples were collected from two sentinel hospitals and detected by double antibody sandwich ELISA method, then the viral RNA were extracted from positive samples and made G/P genotyping with two-step nested multiplex RT-PCR. Meanwhile, clinical and epidemiological information of positive cases were also analyzed. Results showed that 688 positive samples of group A rotavirus were detected from 2 098 diarrhea samples and the total positive rate was 32.8% with the highest positive rate in 2013 (46.4%) and the lowest positive rate in 2009 (26.7%). There were two seasonal positive rate peaks in autumn and spring season. G9P[8],G2P[4],G3P[8]and G1P[8]were the main combination genotypes. It also existed mixed infection types. The cases distributed from age of 4 months to 1 years old mainly, with no or mild clinical symptoms mostly.In conclusion a higher infection rate of group A rotavirus is in children under 5 years old in Henan Province, the pathogen can be divided into various genotypes and infection cases had significant epidemiological characteristics.

group A rotavirus; children; genotyping; epidemiologic features

Xu Bian-li, Email: xubl@hncdc.com.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.016

许汴利，Email: xubl@hncdc.com.cn

河南省疾病预防控制中心传染病所，郑州 450016

R373.2

B

1002-2694(2016)10-0934-05

2016-03-21；

2016-09-20

十二五科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项”(No.2013ZX10004203；2012ZX10004215)，河南省科技攻关课题(No.152102310133)

Supported by the National Science and Technology Major Projects of China (Nos. 2012ZX10004215 and 2013ZX10004203), the Scientific and technological project of Henan Province “Molecular typing and network tracing technology application research of bacterial pathogens” (No. 152102310133)