梅州地区小儿感染肺炎支原体生物群分布与耐药性差异研究

肖光文，李舟文，张国雄，徐美兰，乔亚峰，曾令斌



梅州地区小儿感染肺炎支原体生物群分布与耐药性差异研究

肖光文1，李舟文1，张国雄2，徐美兰1，乔亚峰1，曾令斌1

目的 了解梅州地区儿童肺炎支原体流行株的基因分型及不同型别间对大环内酯类药物的耐药性差异。方法对2015年1月到2015年12月期间865例小儿肺炎患儿进行咽拭子肺炎支原体培养，并检测对红霉素、罗红霉素、阿奇霉索、乙酰螺旋霉素、克林霉素和克拉霉素6种药物的敏感性。采用基于MpP1基因的巢式多重PCR方法进行Mp基因亚型的监测并分析不同基因型对大环内酯类药物的耐药性差异。结果 对肺炎支原体培养的结果表明，Mp培养阳性数为289例，总阳性率为33.41%。其中P1-I型为246例，占85.12%，P1-II型为43例，占14.88%。196例出现大环内酯类抗菌药物耐药的Mp阳性标本中，P1-I型为191例，占P1-I型的77.64%；P1-II型仅5例，占P1-II型的11.63%。P1-I型的耐药率明显高于P1-II型(χ2=73.09，P<0.01)。结论Mp仍是梅州地区儿童肺炎的主要病原体之一，其流行基因型以P1-I型为主，同时也存在P1-II型菌株；在控制Mp的感染方面应重视耐药菌株的克隆传播。

肺炎支原体；儿童；基因型；耐药性差异

Supported by the Guangdong Medical Scientific Research Funds (No. B2015036) and the Meizhou City Science and Technology Plan Projects (No. 2015B041)

肺炎支原体 (Mycoplsmapneumoniae，Mp)是引起成人和儿童支气管肺炎，间质性肺炎的常见病原体之一。随着对Mp感染的认识的加强，其检测技术、分型及耐药等方面的研究迅速在国内外开展。Mp感染过程中，主要通过黏附蛋白-P1基因编码的P1蛋白完成对宿主细胞的粘附与定植。目前对Mp的分型主要是基于P1基因序列通过巢氏多重PCR法建立的分型体系[1]，将肺炎支原体分为1型、2型菌株和Variant 2型。检测P1基因分型可以明确Mp暴发流行情况，同时明确耐药Mp菌株之间是否存在克隆传播的可能性，为预防和干预梅州地区小儿肺炎支原体肺炎( Mycoplasma Pneumonia Pneumonia，MPP)的发生及临床治疗提供理论指导。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2015 年 1 月到 2015 年 12月，本市3家综合医院儿科门诊及住院部治疗的符合《社区获得性肺炎诊断和治疗指南》 诊断标准的小儿肺炎患儿 865例，其中，男 453例，女 412例；支气管肺炎 642 例，大叶性或节段性肺炎110 例，支气管炎 79 例，毛细支气管炎 24 例。病程为3～15 d。

1.2 主要仪器与试剂 离心机为美国 Beckman公司产品，基因扩增仪、电泳仪为美国Biorad公司产品，凝胶成像系统为法国VL公司产品，细菌基 因组 DNA 提取试剂盒为北京康为世纪公司产品，快速培养及药敏试剂盒为陕西百盛园公司产品。MpP1-I型标准株 M129 和 P1-II型标准株Mp-FH 均由由美国 Type Culture Collection 公司提供。

1.3 培养及药敏试验Mp采用快速鉴定培养法，其其检测原理为Mp利用培养基内快速生长因子进行增殖，在分解糖类过程中产生的氢离子使培养基的 pH值降低而使酚红指示剂由红色变成淡黄色，培养基由红变黄并液体澄清为有Mp生长。同时利用药敏孔中抗菌药物的高低浓度在体外对微生物的抑制作用，对Mp作耐药性分析。药敏结果判读:两孔均呈红色为敏感；低浓度孔呈黄色、 高浓度孔呈红色为中介；两孔均呈黄色为耐药。咽拭子标本统一入院次日早晨采集并立即送检。操作步骤如下：1)取1支分装干粉培养基，在无菌条件下打开盖子，加入1.5 mL超纯水，完全溶解至澄清后，在药敏板阴性孔中加入50 μL培养液。2)将棉拭子置于培养瓶内，搅动数次，提取棉拭子并对着瓶壁尽量挤压出其中液体，取出棉拭子弃之，用加样器吹打数次后分别吸取50 μL 加入各药敏板孔中。3)在每个板孔中滴加1滴石蜡油封口后，将瓶中剩余培养基弃去，药敏板置于 37 ℃电热培养箱培养24 h。4)取出观察结果并统计阳性标本及阳性标本红霉素、罗红霉素、阿奇霉索、乙酰螺旋霉素、克林霉素、和克拉霉素6种药物的药敏结果。

1.4Mp-DNA提取和用巢式PCR分型 根据DNA提取试剂盒说明提取阳性培养物中的Mp-DNA。根据MpP1基因多态性，参照Kenri等[2]方法运用对P1基因上RepMp4和RepMp2/3两个可变区域设计合成引物，引物位置见图1，各组引物序列参照李东等[3]相关报道，引物Invitrogen公司合成。利用引物ADH2F/ ADH2R、 ADH3F/ ADH3R、ADH3/ Mp2/3-R1、Mp2/3-R2/ Mp2/3-F2对阳性培养物的Mp-DNA扩增。 PCR反应体系为10×loading缓冲液 5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L 上下游引物各 1 μL， DNA 3 μL，AmpliTaq(Amplitaq酶购自上海TaKaRa公司)0.3 μL，加入ddH2O直至反应体系达25 μL。反 应条件为：98 ℃，预变性2 min； 98℃变性15 s， 58℃退火15 s， 72℃延伸1 min， 30 个循环；72 ℃ 延伸 3 min。扩增产物稀释 1 000 倍作为模板进行巢式PCR，RepMP4区域分型扩增所用引物为ADH4F、N1、2N2C，RepMp2/3 区域分型扩增所用引物为 Mp2/3-F3、R31、R32、R32V。PCR反应体系和条件同前。取12 μL PCR产物样品中 加入1 μL 6×Loading缓冲液，用移液器反复吸取数次 后在2.5%琼脂糖凝胶中电泳。用凝胶图像分析系统观察并保存结果。

图1 P1基因序列构成及相关引物Fig.1 Composition of P1 gene sequence and related primers

1.5 测序 在紫外自动成像仪下，用刀片割下含目的 DNA 片段的凝胶块，放入 EP 管中-20 ℃保存，送上海生工进行测序。

1.6 统计学分析 数据采用 SPSS 20.0软件进行分析，对于不同型别Mp耐药性进行分析，采用χ2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2015年Mp的流行情况 865例CAP患儿咽拭子标本中，Mp培养阳性数为289例，总阳性率为33.41%。男性感染161例，感染率为35.54%；女性感染128例，感染率为31.07%。男性感染率略高于女性，对2组进行比较，差异无统计学意义(χ2=1.94，P>0.05)。4个不同季节组Mp感染阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=35.58，P<0.05)。其中春(2～4月)夏(5～7月)感染率明显高于秋(8～10月)冬(11～1月)季节。其中又以春季最高达到41.36%。

表1 2015梅州地区CAP患儿不同季节Mp的感染率
Tab.1 Infection-rates of Mp in different season groups in children with CAP in Meizhou area in 2015

Seasongroup(month)Mp+-TotalInfectionrate(%)2～413419032441.365～78116925032.408～103811315125.1611～13610414025.71Total28957686533.41

注：四个不同季节组间感染阳性率比较，χ2=17.65，P<0.05。

Note： The comparison of infection positive rate between four different seasons groups, χ2=17.65,P<0.05.

2.2 药敏结果 有196份Mp阳性培养物对儿童常用的 6 种大环内酯类抗菌药物红霉素、罗红霉素、阿奇霉索、乙酰螺旋霉素、克林霉素和克拉霉素的一种或几种出现了耐药，其针对6 种抗菌药物的耐药率分别为59.17%(171/289)、52.60%(152/289)、35.64%(103/289)、32.87%(95/289)、28.37%(82/289)和34.26%(99/289)。

2.3 巢式PCR分型结果 针对可变区域 RepMP4，用巢式PCR 方法对289例Mp阳性培养物及标准株 M129、Mp-FH进行扩增产生两种特征性条带。其中有243例临床标本得到343 bp的基因片段， 与 M129标准株扩增到的基因片段相同， 即为 P1-I型； 40例临床标本得到560 bp的基因片段，与MP-FH标准株扩增到的基因片段相同，即为P1-II型。(见图2)针对可变区域RepMP2/3，Mp阳性培养物及标准株 M129、Mp-FH也产生两种特征性条带。其中有243例临床标本得到394 bp的基因片段，与 M129标准株扩增到的基因片段相同， 即为 P1-I型； 40例临床标本得到617 bp的基因片段，与MP-FH标准株扩增到的基因片段相同，即为 P1-II型。(见图4)。另外6例没有出现目标基因片段，可能为假阳性。最终确认289份Mp阳性中P1-I型为243例，占85.87%(243/283)，P1-II型为40例，占14.13%(40/283)。

1: standard strains Mp-FH; 2: P1-IIstrains; 3: standard strains M129; 4: P1-Istrains.图2 Mp阳性培养物及标准株针对RepMP4的基因分型Fig.2 Mp positive cultures and standard strains of genotyping for RepMP4

1: standard strains M129; 2: P1-Istrains; 3: standard strains Mp-FH; 4: P1-IIstrains图3 Mp阳性培养物及标准株针对RepMP2/3的基因分型Fig.3 Mp positive cultures and standard strains of genotyping for RepMP4

2.4 大环内酯类耐药菌种与Mp基因型别的关系 196例出现大环内酯类抗菌药物耐药的Mp阳性标本中，P1-I型为187例，占P1-I型的76.95%(187/243)；P1-II型仅5例，占P1-II型的12.5%(5/40)；另外4例可能为假阳性。两组比较，P1-I型的耐药率明显高于P1-II型(χ2=73.09，P<0.01)。

2.5 测序结果和同源性分析 分别随机各选取2～4月间感染的10份对红霉素耐药和敏感的P1-I型以及全部5份对红霉素耐药的P1-II型和5份敏感的P1-II型阳性标本的测序结果递交 GenBank 数据库进行 BLAST 搜索，结果显示前20份标本均属于 MP P1-I型，后10份标本均为P1-II型；其中对红霉素耐药的10份P1-I型标本具有高度的同源性，互相间比较同源性介于99.6%～100%；而对红霉素敏感的10份P1-I型标本虽然也有较高的同源性，却只是介于97.2%～100%。后10份P1-II型标本，相互间同源性介于97.1%～100%，红霉素耐药株与敏感株间同源性无明显差异。

3 讨 论

近年来，Mp的感染呈递增的趋势，国内感染率在30%[4]左右，作者对2010-2014年梅州地区儿童Mp感染及耐药情况进行回顾性分析[5]，表明总阳性率为35.11%，高于国内今年相关报道。从本研究继续对该地区儿童Mp感染的情况分析，2015年度该地区儿童Mp感染率为33.41%，继续保持了较高的感染率；男性和女性Mp感染率的差异仍无统计学意义；从季节来看，春夏感染率仍高于秋冬。其针对6 种抗菌药物的耐药率分别为59.17%(171/289)、52.60%(152/289)、35.64%(103/289)、32.87%(95/289)、28.37%(82/289)和34.26%(99/289)。与2010-2014年情况梅州地区耐药情况比较，跟2014年[5]耐药率相近。以上情况表明，2015年度该地区Mp流行特征没有改变。

近年来,Mp的分型研究已经成为的流行趋势[6]。对Mp全基因测序已经证实，在打的重复序列RepMp8内有个拷贝是RepMp2/3和RepMp4被证实位于P1操作子中，并且他们包含变异序列P1外源凝集素及粘附相关蛋白B/C。Mp大量重复元素在染色体上的蔓延使临床分离株大量重复序列发生同源性重组成为可能，同时也使得Mp的基因分型变得较为困难。目前Mp的分型方法主要依赖于P1基因的RepMp2/3和RepMp4两部分进行的多重巢式PCR、PCR-RFLP和基因测序等方法，以及不依赖于P1 基因的PFGE 和RAPD等方法。研究表明几种方法对于相同菌株的分型结果基本一致[7]。基于P1基因的RepMp2/3和RepMp4两部分的研究有助于我们掌握Mp的分型及不同菌株之间的同源性。本研究中我们采用了基于P1基因的RepMp2/3和RepMp4两部分进行的多重巢式PCR法，结果显示289份Mp阳性中P1-I型为246例(85.12%)，P1-II型为43例(14.88%)。表明在2015年期间该地区Mp的感染以P1-I型为主，与欧洲某些国家及我国大部分地区近几年检测的结果相似[3，8]。

Pl基因编码的产物Pl蛋白是Mp的主要黏附素及毒力因子，同时作为一种重要的免疫原能刺激机体产生强烈的应答效应。就目前的研究表明，基于Pl基因的分型临床分离菌株无论是P1-I型，P1-II型还是其他的变异新型株均有致病性[9]，型别的差异并没有在Mp的致病性上体现出差异。但是有研究表明，不同基因型Mp对大环内酯类抗菌药物耐药之间存在重要的相关性[10]。本研究对大环内酯类耐药菌株与Mp基因型别的关系进行了分析，研究结果表明P1-I型菌株对大环内酯类药物的耐药率显著高于P1-II型。对Mp耐药机制研究中，目前国内外的报道主要认为Mp对大环内酯类药物的耐药与其结合位点的基因突变有关，其中又以编码23S rRNA V区和Ⅱ区的基因和编码核糖体蛋白L4、L22的基因发生点突变密切相关，而不受Pl基因的点突变的影响。从基因测序的结果表明，选取的2～4月间感染的对红霉素耐药的10株P1-II型菌株具有高度的同源性(99.6%～100%)，这种同源性提示我们耐药菌株间存在克隆传播的可能。对红霉素耐药和不耐药的P1-II型菌株互相间同源性(97.1%～100%)无明显差异，可能与其为全年散发有关。因此，我们有理由相信，P1-I型菌株对大环内酯类药物的耐药率显著高于P1-II型的原因与耐药菌株间可能存在的克隆传播密切相关。Kenri 等[2]、Pereyre 等[11]和 Martinez 等[12]都发现，Mp基因型别可以在P1-I型和P1-II型之间自然转变交替流行的现象，其原因可能与人群免疫力有关，这种转变的周期可能为8～10年。根据以上推测，当某地发生转变而出现Mp的感染以P1-II型为主时，P1-II型耐药菌株间也存在可能的克隆传播，那么P1-II型对红霉素的耐药率也许不会像本研究一样显著低于P1-I型菌株了。

本研究的结果表明，Mp仍是梅州地区儿童肺炎的主要病原体之一，其流行基因型以P1-I型为主，同时也存在P1-II型菌株。P1-I型耐药菌株的克隆传播可能引起耐药菌株的广泛流行，我们应特别的重视。同时我们也应该密切监测P1-II型耐药菌株可能的克隆传播并关注Mp基因型转换进而出现新的流行亚型。

[1] Kong F, Gordon S, Gilbert GL. Rapid-cycle PCR for detection and typing ofMycoplasmapneumoniaein clinical specimens[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(11): 4256-4259.

[2] Kenri T, Okazaki N, Yamazaki T, et al. Genotyping analysis ofMycoplasmapneumoniaeclinical strains in Japan between 1995 and 2005: type shift phemomenon ofM.pneumoniateclinical strains[J]. J Microbiol Methods, 2008, 57: 469-475.

[3] Li D, Fan LP, Sun HQ. Genotyping analysis of epidemic strains ofMycoplasmapneumoniaein Suzhou area[J]. J Clin Pediatr, 2015, 33(4): 338-341. (in Chinese)

李东, 范丽萍, 孙惠泉. 肺炎支原体流行株基因分型研究[J]. 临床儿科杂志, 2015, 33(4) :338-341.

[4] Yang AM, Song JH, Huang R, et al.Mycoplasmapneumoniainfection and drug resistance in children: an analysis of 1026 cases[J]. Chin J Contemp Pediatr, 2013, 15(7): 522-525. (in Chinese)

阳爱梅,宋建辉,黄榕,等.1026例儿童肺炎支原体感染及耐药情况分析[J].中国当代儿科志,2013,15(7):522-525.

[5] Li ZW, Xiao GW, Zhang GX, et al.Mycoplasmapneumoniaeinfection and drug resistance in children in Meizhou area from 2010 to 2014[J]. Chin J Zoonoses, 2016,32(3): 306-311. (in Chinese)

李舟文, 肖光文, 张国雄, 等. 梅州地区2010-2014年儿童肺炎支原体感染及耐药情况分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2016，32(3)：306-311.

[6] Dumke R, Catrein I, Herrmann R, et al. Adaptation and survival ofMycoplasmapneumoniaesubtypes in an animal model[J]. Int J Med Microbiol, 2004, 294: 149-155.

[7] Kenri T, Okazaki N, Yamazaki T, et al. Genotyping analysis ofMycoplasmapneumoniaeclinical strains in Japan between 1995 and 2005: type shift phenomenon ofM.pneumoniaeclinical strains[J]. J Med Microbiol, 2008, 57(4): 469-475.

[8] Wang N, Zhang K, Zhang GC. Genotyping ofMycoplasmapneumoniaestrains in Xi’an[J]. J Clin Pediatr, 2013, 31(5): 455-458. (in Chinese)

王楠, 张凯, 张国成. 儿童肺炎支原体西安流行株的基因分型 [J]. 临床儿科杂志, 2013, 31(5)：455-458.

[9] Cao B, Zhao CJ, Yin YD, et al. High prevalence of macrolide resistance inMycoplasmapneumoniaeisolates from adult and adolescent patients with respiratory tract infection in China[J]. Clin Infect Dis, 2010, 51: 189-194．

[10] Pereyre S, Guyot C, Renaudin H, et al.Invitroselection and characterization of resistance to macrolides and related antibiotics inMycoplasmapneumonia[J]. Antimicrobial Agents Chemother, 2004, 48: 460-465.

[11] Pereyre S, Charron A, Renaudin H, et al. First report of macrolide resistant strains and description of a novel nucleotide sequence variation in the P1 adhesin gene inMycoplasmapneumoniaeclinical strains isolate in France over 12 years[J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(11): 3534-3539.

[12] Martinez MA, Ruiz M, Zunino E, et al. Identification of P1 types and variants ofMycoplasmapneumoniaeduring an epidemic in Chile[J]. J Med Microbiol, 2010, 59(Pt 8): 925-929.

Mycoplasmapneumoniaeserotypes distribution and drug resistance in Meizhou area, China

XIAO Guang-wen1, LI Zhou-wen1, ZHANG Guo-xiong2,XU Mei-lan1, QIAO Ya-feng1, ZENG Ling-bin1

(1.MedicalCollege,JiayingUniversity,Meizhou514031,China;2.ClinicalLaboratory,thePeople’sHospital,Meizhou514000,China)

In order to survey the genotype ofMycoplasmapneumonia(Mp) strains isolated from children withMpinfection and the drug resistance difference of genotypes to large ring lactone class of drugs in Meizhou area, a total of 865 throat swabs were collected from children with pneumonia in Meizhou area from January 2015 to December 2015. The swabs were cultured to detectMp. The drug sensitivity ofMpto erythromycin, roxithromycin, azithromycin, acetylspiramycin, clindamycin and clarithromycin was evaluated. The nested-multiplex PCR based on MP P1 gene was performed to detect the subtype ofMPgene, and the drug resistance difference of genotypes was researched to large ring lactone class of drugs. According to the result of the cultivation ofMp, 289 (33.41%) wereMp-positive, the infection rate of spring and summer was significantly higher than that of autumn and winter. The antimicrobial drug resistant rate for six kinds were 59.17% (171/289), 52.60% (152/289), 35.64% (103/289), 32.87% (95/289), 28.37% (82/289) and 34.26% (99/289) respectively. From the result of classification, the 243 cases of type (85.87%) were P1-I strains, 40 cases (14.13%) were P1-II strains of` these. Among 196 cases with large ring lactone class antibiotic drug resistance ofMppositive samples, 187cases were P1-I strains, accounting for 76.95% (187/243) of the entire P1-I; 5 cases were P1-II, accounting for only 12.5% (5/40) of the entire P1-II. The resistant rate of P1-I strains was significantly higher than P1-II strains (χ2=73.09,P<0.01). In conclusion,Mpis still one of the main pathogen of pneumonia in children in Meizhou area, its popular genotype is given priority to with P1-I, at the same time there is also P1-II, strains.

Mycoplasmapneumonia; child; genotype; drug resistance

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.010

1.嘉应学院医学院，梅州 514031；

2.梅州市人民医院，梅州 514000

R375

A

1002-2694(2016)10-0898-05

2016-05-27；

2016-08-29

广东省医学科学研究基金(No.B2015036)和梅州市科技计划项目(No.2015B041)联合资助

Email：270591805@qq.com