二烯丙基硫化物对百草枯中毒急性肺损伤大鼠的抗氧化作用

曹玉芳，王洪武，苏 醒，侯 宇，管 军，谢 斌，余燕梅，王莲藕，陈颖斌，韩艳丽，邱平，宋 维

（海口市人民医院1.重症医学科；2.肾内科，海南海口570208；3.海南省人民医院急诊科，海南海口570102）

二烯丙基硫化物对百草枯中毒急性肺损伤大鼠的抗氧化作用

曹玉芳1，王洪武1，苏 醒1，侯 宇1，管 军1，谢 斌1，余燕梅1，王莲藕1，陈颖斌1，韩艳丽1，邱平2，宋 维3

（海口市人民医院1.重症医学科；2.肾内科，海南海口570208；3.海南省人民医院急诊科，海南海口570102）

目的探讨二烯丙基硫化物（DAS）对百草枯（PQ）中毒大鼠急性肺损伤的影响。方法100只雄性Wistar大鼠随机分为5组，正常对照组、PQ 70 mg·kg-1模型组、DAS 25，50和100 mg·kg-1治疗组，每组20只。一次性ig给予PQ 70 mg·kg-1制备PQ中毒模型，DAS组于造模前、后30 min ip给予相应剂量药物，正常对照组ip给予等量生理盐水。各组分别于造模后1，3，6和12 h麻醉大鼠，取右肺下叶进行HE染色，光镜下观察肺组织病理损伤程度并评分；右肺上叶进行肺组织一氧化氮（NO）含量检测；左肺进行支气管肺泡灌洗获取肺泡巨噬细胞（AM），培养24 h取上清，分光光度法测定诱导型一氧化氮合酶（iNOS）含量；培养至72 h，采用细胞免疫化学方法检测AM中iNOS蛋白的表达。结果与正常对照组比较，模型组肺泡结构破坏严重，病理评分明显升高（P＜0.01），肺组织中NO含量明显升高（P＜0.01），AM培养上清液中iNOS含量明显升高（P＜0.01），iNOS蛋白表达增加（P＜0.05）；与模型组比较，DAS 50 mg·kg-1组在造模后3，6和12 h以及DAS 100 mg·kg-1组在造模后1，3，6和12 h肺泡结构损伤显著减轻，病理评分降低（P＜0.05）；DAS 25和50 mg·kg-1组肺组织中NO和iNOS含量及iNOS蛋白表达减少（P＜0.05），DAS 100 mg·kg-1组NO含量减少更为明显（P＜0.01）。结论DAS可能通过抑制PQ中毒大鼠肺组织中的氧化损伤因子减轻肺损伤。

百草枯；一氧化氮；诱导型一氧化氮合酶；急性肺损伤；二烯丙基硫化物

百草枯（paraquat，PQ）中毒后死亡率高，国内外尚无有效的治疗手段，是目前治疗的难点和研究的热点。一旦误服，很快被胃肠黏膜吸收并于0.5～2 h达到血浆峰浓度，主要集聚在肺组织，其毒性较强，口服致死量小（口服20%PQ溶液5 mL即可致死）。PQ可经皮肤、呼吸道和消化道3种途径进入体内造成中毒，病程进展快，病死率高达33%～78%［1-2］。

目前，对PQ的毒理作用机制已做了大量工作，但PQ中毒患者死亡率仍然很高，缺乏特效的解毒药物［3-4］，PQ中毒后很快出现多器官功能衰竭致使患者死亡［5-6］。大多数学者认为氧化还原反应是PQ中毒的主要死因。Flora等［7］研究也证实，过度的氧化应激反应累及人体功能紊乱，其中氧、氮、碳和硫等反应分子在氧化应激反应中担任重要角色。在生物体系中，这些自由基或活性氧通常是通过异常代谢激活的。如电离辐射、毒物刺激及炎症细胞分泌等等［8］。PQ进入体内可改变氧化还原循环，但PQ中毒的重要生化反应还不十分清楚。诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是一氧化氮（nitric oxide，NO）的合成酶，由内毒素及多种炎症细胞因子刺激合成，常存在于血管平滑肌细胞、肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages，AM）、成纤维细胞、中性粒细胞及气道上皮细胞中。iNOS激活后产生的过量NO使炎症细胞在肺血管内皮细胞上黏附并相互作用，引起血管通透性增加，导致肺水肿及急性肺损伤。通常iNOS在生理状态下很少表达，但在炎症、中毒、毒素刺激及创伤等情况下其表达增强，并促使NO的分泌增加，高浓度NO可抑制三羧酸循环和DNA复制中的关键酶，造成能量代谢障碍和DNA损伤［9］，并增强NF-κB活性及其下游炎症细胞因子的产生，扩大炎症反应，导致肺损伤进一步加重。

二烯丙基硫化物（diallylsulfide，DAS）为大蒜中提取的化合物，具有较强的抗氧化活性［10-11］。这类有机化合物通过周期素依赖性蛋白激酶阻止G2/M期分裂［12］。本研究旨在模拟人体中毒途径，对AM进行培养，测定iNOS表达，研究DAS的抗氧化作用，以寻找PQ中毒患者的新的救治方法，提高治愈率，降低死亡率。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和主要仪器

20%PQ（河北桃园农药有限公司，批号：20080606，避光保存）；DAS（美国Sigma公司，批号：592-88-1，避光4℃保存）；96T/48T大鼠NO ELISA测定试剂盒（北京方程生物科技有限公司）；IM-30336大鼠iNOS免疫组化检测试剂盒（上海雅吉生物科技有限公司）；CM胎牛血清（武汉博士德生物工程有限公司）；多聚甲醛、二甲苯和乙醇等常规试剂（海南省海口市人民医院中心实验室）。Image-Pro Plus专业图像分析软件（美国Media Cybernetics公司）；BBD6220 CO2培养箱（美国Thermo Scientific公司）；ULT2586-4-v超低温冰箱（美国Revco公司）；3k30台式高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；Ti-E倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；722S型分光光度仪（上海仪电分析仪器有限公司）。

1.2 实验动物、模型制备和分组

5～7周龄清洁级雄性Wistar大鼠100只，体质量为200～250 g，购于四川大学实验动物中心，动物试验资格认可证：川动管第2005-853号。实验前动物适应性饲养2周，每笼5只，温度22～24℃，湿度40%～60%，动物自由进食进水，自然昼夜节律光照；按随机数字表法将Wistar雄性大鼠100只分为正常对照组、模型组及DAS 25，50和100 mg·kg-1组，每组20只。一次性ig给予PQ 70 mg·kg-1制备中毒大鼠模型；造模当日（造模前、后30 min）对DAS组ip给予DAS 25，50和100 mg·kg-1，PQ组和正常对照组ip给予等量生理盐水。动物处置方法符合动物伦理学标准并经过伦理委员会批准。

1.3 肺组织病理观察

各组大鼠分别于造模后1，3，6和12 h给予2.5%水合氯醛麻醉，取大鼠气管、右下肺组织，用4%甲醛固定，HE染色后观察并照相。每张切片观察5个高倍视野，采用Smith等［13］评分方法对肺组织进行病理损伤评分。主要观察指标包括肺水肿、肺泡间质炎症、肺泡间质充血、肺出血、肺不张和透明膜形成。分别进行0～4评分，其中无病理损伤为0分，病变范围＜25%为1分，病变范围占25%～50%为2分，50%～75%为3分，病变满视野为4分，总肺损伤评分为上述各项之和。

1.4 硝酸还原酶法检测肺组织中NO含量

各组大鼠分别于造模后1，3，6和12 h给予2.5%水合氯醛麻醉，无菌状态下取大鼠右上肺组织0.1 g制备成10%的匀浆，以999×g离心15 min后取上清液，检测肺组织NO含量（μmol·g-1蛋白）。

1.5 肺泡巨噬细胞分离培养及iNOS含量测定

各组大鼠分别于造模后1，3，6和12 h给予2.5%水合氯醛麻醉，左肺进行支气管肺泡灌洗。收集支气管肺泡灌洗液，离心获取细胞，用差速贴壁方法分离纯化AM，30 min可见较多的AM贴壁，通过换液将大量的未贴壁细胞换去，获得纯度较高的贴壁细胞。于37℃，5%CO2温箱中培养24 h，取上清按试剂盒步骤测定，计算iNOS含量（μmol·L-1）。

1.6 肺泡巨噬细胞中iNOS蛋白表达测定

弃去AM培养上清，继续培养72 h。用Wright-Giemsa染色观察AM活性状态并证实贴壁细胞为巨噬细胞，采用倒置显微镜下观察，纯度＞90%。对培养的AM进行免疫荧光细胞化学方法检测iNOS蛋白表达。Image-promedia图像分析系统进行平均吸光度值（average absorbance，AA）分析。每张切片摄取5个视野。

1.7 统计学分析

实验结果数据以x±s表示，经SPSS 20.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较进行t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二烯丙基硫化物对百草枯中毒大鼠肺组织病理变化的影响

HE染色结果见图1，正常对照组肺泡结构完整，肺泡壁无水肿，肺实质无炎症细胞浸润。PQ中毒组肺部炎症明显，肺泡壁有明显水肿、增厚及肺泡间隔断裂，肺间质增生及肺泡结构破坏，肺间质及肺泡腔炎症细胞浸润，部分肺泡腔形成透明膜。而DAS治疗组随着给药浓度增加，肺组织仅有部分增生、少量炎症细胞浸润，肺泡结构破坏逐渐减轻，肺泡腔内无透明膜形成。肺组织病理评分结果（表1）表明，与正常对照组比较，模型组病理评分明显升高（P＜0.01）。与PQ模型组比较，DAS 50 mg·kg-1组在（3，6和12 h）时段和DAS 100 mg·kg-1组在各时段病理评分降低（P＜0.05）。

2.2 DAS对大鼠肺组织中NO含量的影响

由表2可见，与正常对照组比较，模型组NO含量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，DAS 25和50 mg·kg-1组NO含量减少（P＜0.05），DAS 100 mg·kg-1组NO含量明显减少（P＜0.01）。提示DAS可降低PQ中毒大鼠肺组织中NO含量。

Fig.1 Effect of diallyl sulfide（DAS）on morphology of lung tissue damage induced by paraquat（PQ）（HE staining）. DAS was intraperitoneally injected before and after 30 min PQ 70 mg·kg-1exposure.Five rats in each group were sacrificed after PQ exposure at 1，3，6 and 12 h respectively.The blue arrows show a large number of inflammatory cells and collagen deposition.The black arrows show hyaline membrane formation.

Tab.1 Effect of DAS on lung injury score of rats induced by PQ

2.3 DAS对百草枯中毒大鼠肺泡巨噬细胞上清液中iNOS含量的影响

由表3可见，模型组iNOS含量自1 h开始明显升高，3和6 h达到高峰，12 h又逐渐降低。与正常对照组相比，模型组iNOS含量显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，DAS 100 mg·kg-1组iNOS含量显著降低（P＜0.05）。提示DAS 100 mg·kg-1可降低PQ中毒大鼠AM分泌的iNOS含量。

Tab.2 Effect of DAS on content of nitric oxide（NO）of rats with acute lung injury induced by PQ

Tab.3 Effect of DAS on content of inducible nitric oxide synthase（iNOS）in culture medium of alveolar macro⁃phages of rats with acute lung injury induced by PQ

2.4 DAS对百草枯中毒大鼠肺泡巨噬细胞中iNOS蛋白表达的影响

免疫荧光结果显示（图2），AM培养72 h后，正常对照组AM胞浆无亮绿色阳性反应，模型组中AM胞浆有明显亮绿色阳性反应，DAS组中可见少量亮绿色阳性反应，提示DAS对AM中iNOS表达具有下调作用。免疫荧光AA值结果表明，与正常对照组AA值（2.3±0.05）比较，模型组AA值（6.1±0.15）显著升高（P＜0.01，t=7.214）。与模型组比较，DAS 25，50和100 mg·kg-1组AA值（5.59±0.311，5.48± 0.58和5.01±0.19）均降低（P＜0.05）。提示DAS具有抗PQ中毒所致肺部氧化损伤作用。

Fig.2 Effect of DAS on iNOS protein expression of alveolar macrophages of rats with acute lung injury by direct immunofluorescence and fluorescence micros⁃copy.See Fig.1 for the rat treatment.The arrows indicate the expression of iNOS in the alveolar macrophages.

3 讨论

本研究发现，通过PQ造模后，大鼠表现为蜷缩、自发活动减少、毛发竖起、呼吸急促、进食饮水量明显减少。给予DAS治疗组大鼠自发活动无明显减少，部分大鼠毛发有竖起，进食进水量稍有减少，无明显呼吸急促；PQ组肺组织病理见肺泡结构破坏、肺间质增厚、大量炎症细胞浸润，肺泡腔内透明膜形成。在治疗组肺泡结构部分破坏、炎症细胞浸润较PQ组明显减少，无明显肺泡内透明膜形成；BALF分离纯化AM并培养，取其上清液检测iNOS含量及AM中iNOS蛋白的表达，发现PQ中毒发生后AM中iNOS的含量及蛋白表达明显增强，并随时间延长而逐渐增强，给予DAS干预治疗后，治疗组iNOS蛋白表达及含量显著降低；因氧化应激在急性肺损伤中占有重要地位［14］，DAS通过增加谷胱甘肽S-转移酶、谷胱甘肽还原酶和过氧化氢酶的活性等途径达到抑制氧化损伤的作用［15］。由于该物质是大蒜中提取的一种化合物，通过抑制氧化损伤来阻断肺损伤的进一步加重，从而改善肺功能，纠正大鼠低氧血症。而中毒者多为从事农业生产的劳动者，距离医院相对较远。本研究结果提示，当患者PQ中毒后，尽快口服一定量的大蒜，进行第一时间的抗炎及抗氧化治疗，为后期就医挽救生命提供机会。也可通过提纯后获得制剂直接进行呼吸道雾化，使DAS直接作用于肺部抑制氧自由基释放及iNOS蛋白表达，下调NO含量来减轻肺部氧化损伤，抑制或逆转肺纤维化的形成。本研究不足之处，用细胞免疫化学方法对AM中iNOS进行半定量分析，使得切片能长期保存、反复观察。但酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶的活性，易产生非特异染色。故细胞免疫化学方法中存在的不足，通过取上清液用分光光度计检测各时间点iNOS水平以弥补细胞免疫化学方法的不足，该方法稳定性好，可重复性强。该研究与Kalayarasan等［16］研究博来霉素引起肺纤维化结论相符。

综上所述，PQ中毒后患者随剂量及中毒时间的不同而有不同预后，现尚无确切的治疗手段，死亡率高。DAS为大蒜中提取的化合物，已有大量实验证明其具有抗炎抗氧化损伤作用。因此，DAS抗氧化作用并非偶然现象，但迄今仍无DAS能用于PQ中毒所致肺损伤方面研究，下一步需要进行更深入的定量研究和临床研究。如将DAS制造为喷雾剂，进行雾化吸入，直接作用于肺部，以减轻肺氧化损伤及抑制肺纤维化进程。为降低PQ中毒患者死亡率，提高治愈率寻找新路径。

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Antioxidanteffectofdiallylsulfide on acute lung injury in rats with paraquat poisoning

CAO Yu-fang1，WANG Hong-wu1，SU Xing1，HOU Yu1，GUAN Jun1，XIE Bing1，YU Yan-mei1，WANG Lian-ou1，CHENG Ying-bing1，HAN Yan-li1，QIU Ping2，SONG Wei3
（1.Department of Critical Care Medicine，2.Department of Nephrology，Haikou Municipal People′s Hospital，Haikou 570208，China；3.Department of Emergency Medicine，Hainan Provincial People′s Hospital，Haikou 570102，China）

OBJECTIVE To investigate the effect of diallyl sulfide（DAS）in protection against acute lung injury in rats induced by paraquat（PQ）.METHODS A total of 100 male Wistar rats were randomly divided into normalcontrolgroup，PQ 70 mg·kg-1modelgroup，and DAS 25，50 and 100 mg·kg-1treatmentgroups，with 20 rats in each group.A poisoning modelwas estalolished after administration ig ata single dose of PQ 70 mg·kg-1，while the normalcontrolgroup was ip given the same volume ofnormal saline.DAS 25，50 and 100 mg·kg-1was intraperitoneally injected 30 min before and after PQ exposure. Five rats in each group were sacrificed at 1，3，6 and 12 h，respectively.The inferior lobe ofthe right lung was observed by HE staining under an opticalmicroscope.Tissue of the upper lobe of the right lung was used to detect the content of nitric oxide（NO）.Alveolar macrophages（AMs）were collected and cultured for 24 h，and the contentofnitric oxide synthase（iNOS）in the supernatantwas detected.AMs were cultured for 72 h and the expression of iNOS protein in AMs was detected by immunocytochemistry method.RESULTS Compared with normalcontrolgroup，the alveolar structure of PQ group was severely damaged and the pathologicalscore was significantly increased（P＜0.01）. The NO contentof PQ group was significantly higher than in normalcontrolgroup（P＜0.01）.The content and protein expression ofiNOS were significantly increased in PQ group（P＜0.01）.Compared with PQ group，the lung injury score ofrats in DAS 50 mg·kg-1group at3，6 and 12 h and in the DAS 100 mg·kg-1group at each time point was decreased（P＜0.05）.Compared with PQ group，the NO content of DAS 25 and 50 mg·kg-1group was decreased（P＜0.05），and the NO content of DAS 100 mg·kg-1group was significantly reduced（P＜0.01）.The content of iNOS was reduced in DAS 100 mg·kg-1group（P＜0.05）.Compared with PQ group，the expression of iNOS protein in DAS groups was decreased（P＜0.05）.CONCLUSION DAS can inhibitthe oxidative damage in rats induced by PQ.

paraquat；nitric oxide；inducible nitric oxide synthase；acute lung injury；diallylsulfide

The projectsupported by NaturalScience Foundation of Hainan Province（310143）

QIU Ping，Tel：13807565230，E-mail：hksn@163.com；SONG Wei，Tel：13005019731，E-mail：swhn1212@aliyun.com

R285.5

A

1000-3002-（2016）05-0526-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.007

2015-07-24接受日期：2016-04-15）

（本文编辑：贺云霞）

海南省自然科学基金（310143）

曹玉芳，女，博士研究生，主要从事百草枯中毒研究，E-mail：cyf12636@163.com

邱平，Tel：13807565230，E-mail：hksn@163.com；宋维，Tel：13005019731，E-mail：swhn1212@aliyun.com