贝伐珠单抗促进小鼠结直肠癌肺转移的作用及可能机制

陈亚琼，李媛媛，吕忠霖，陈国江，彭 晖，3

（1.中国药科大学药学院，江苏南京210009；2.军事医学科学院基础医学研究所免疫学研究室，北京100850；3.军事医学科学院卫生学环境医学研究所环境药学研究室，天津300050）

贝伐珠单抗促进小鼠结直肠癌肺转移的作用及可能机制

陈亚琼1，李媛媛2，吕忠霖2，陈国江2，彭 晖1，3

（1.中国药科大学药学院，江苏南京210009；2.军事医学科学院基础医学研究所免疫学研究室，北京100850；3.军事医学科学院卫生学环境医学研究所环境药学研究室，天津300050）

目的研究贝伐珠单抗治疗与结直肠癌肺转移的相关性及机制。方法BALB/c-nu小鼠脾内注射指数生长期的HCT116细胞，建立小鼠结直肠癌肝转移模型。16只模型小鼠分为贝伐珠单抗治疗组和对照组，每组8只。治疗组ip给予贝伐珠单抗5 mg·kg-1，对照组给予相同剂量的同型对照IgG，分别于建模前2 d及建模后2 d各给药1次，之后每5 d给药1次，连续给药4周，共计给药7次。给药结束后处死小鼠，取出肝、肺器官，肉眼观察肝、肺表面转移灶；HE染色法观察小鼠肝、肺组织转移灶；定量RT-PCR检测小鼠肺组织趋化因子受体4（CXCR）及其配体CXCL12 mRNA的表达。结直肠癌细胞HCT116体外与贝伐珠单抗5 mg·L-1共孵育24 h，Western蛋白印迹法和定量RT-PCR分别检测血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）/CXCR4/CXCR7蛋白和CXCR3/4/7 mRNA的表达水平。结果肉眼观察发现，贝伐珠单抗治疗组小鼠2/8出现肝转移，较对照组（6/8肝转移）明显减少（P＜0.05）；贝伐珠单抗治疗组小鼠8/8出现肺转移，较对照组（2/8肺转移）明显增加（P＜0.05）；小鼠肺组织中鼠源CXCR4及人源CXCL12 mRNA表达显著高于对照组（P＜0.05）。HCT116细胞体外经贝伐珠单抗诱导后，VEGFR1蛋白，CXCR4/7 mRNA和蛋白表达显著升高（P＜0.05），而CXCR3表达无明显变化。结论贝伐珠单抗可能通过上调CXCR4及其配体CXCL12的表达促进结直肠癌的肺转移。

贝伐珠单抗；结直肠癌；转移；趋化因子受体

肿瘤的生长及转移与其自身的供血密切相关，抑制肿瘤血管形成能够显著抑制肿瘤生长并增加化疗药物向肿瘤内部的输送，提高化疗效果。血管生成调节主要与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族尤其是VEGF-A有关［1］。VEGF及其受体（VEGF receptor，VEGFR）能够诱导细胞增殖，促进新生血管的形成。正常生理水平的VEGF-A表达很低，但在代谢旺盛、供血丰富的组织中，由于血管生长的需要，血管内皮细胞VEGF-A表达水平显著升高。肿瘤的生长有赖于血管为其提供丰富的营养物质和氧气。因此，在多种肿瘤中，肿瘤细胞及血管内皮细胞均存在较高水平的VEGF-A表达。抗VEGF治疗能够显著抑制肿瘤血管的形成，减缓肿瘤的发展，以VEGF为靶点的抗肿瘤治疗已经成为多种肿瘤临床治疗，尤其是转移性结直肠癌（meta⁃static colorectalcancer，mCRC）治疗的主要手段之一［2］。结直肠癌的发病率及死亡率均位于各类恶性肿瘤前列，阻碍结直肠癌治疗的主要因素为结直肠癌的肝转移和肺转移［3］。VEGF单克隆抗体贝伐珠单抗（bevacizumab）与常规化疗药联合治疗mCRC较单独化疗能够显著提高患者的耐受性和生存率［3］。也有报道称，抗血管生成治疗会促进部分患者肿瘤的远端转移［4］，如贝伐珠单抗会诱导结直肠癌细胞的恶性表型［5］，诱导化疗耐药和肿瘤复发。VEGF能够通过结合VEGFR1诱导趋化因子受体4（chemokine receptor-4，CXCR4）的表达，调控肿瘤的趋向性转移和侵袭。CXCR4与CXCR7主要通过与CXC配体12（CXC ligand 12，CXCL12）结合［6］，介导信号激活，而CXCR3与CXCR4共用部分趋化因子配体，且CXCR3与肿瘤转移有关［7］。阻断CXCR4及其配体CXCL12能够抑制肿瘤血管形成和肿瘤细胞存活，抑制肿瘤转移［8］。贝伐珠单抗与化疗联用对部分结直肠癌患者无效可能与贝伐珠单抗诱导CXCR4及其配体CXCL12上调后肿瘤代偿性血管形成增加有关，这与高水平CXCL12与结直肠癌转移密切相关的报道［9］一致。为了研究贝伐珠单抗与结直肠癌肝转移和肺转移的相关性，本课题组建立了小鼠结直肠癌肝转移模型并对其进行了贝伐珠单抗治疗，同时对相关指标进行了检测。

1 材料与方法

1.1 细胞和动物

结直肠癌细胞HCT116购自美国模式菌种收集中心。SPF级BALB/c-nu小鼠，雄性，体质量18～22 g，4周龄，购自斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，动物合格证号：11401500005896。小鼠饲养于北京国家药物安全评价中心。

1.2 试剂和仪器

贝伐珠单抗（25 mg·mL-1，瑞士Roche制药公司），IgG（5 mg·mL-1，美国Biolegend公司），RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，元亨金马公司），氯胺酮（ketamine）和赛拉嗪（xylazine）（福建吉田制药有限公司），人VEGF-A ELISA试剂盒（美国eBioscience公司），2×Taq PCR Mix（天根生化科技有限公司），Trizol（Invitrogen公司），逆转录试剂盒（英国新英格兰Biolabs公司），SYBR®Green Real-time PCR Master Mix（日本TOYOBO公司），10%甲醛（广州化学试剂厂），相应引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成（表1）。二氧化碳孵箱、低温离心机和酶标仪（美国Thermo公司），细胞培养板（美国Corning公司），普通PCR仪和iQ5实时定量-PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 结直肠癌肝转移小鼠模型的建立及贝伐珠单抗治疗

收集指数生长期HCT116细胞，PBS洗2次，计数，用生理盐水按照注射要求重悬细胞。每只裸鼠ip 40μL麻醉药〔氯胺酮∶赛拉嗪∶生理盐水=1.5∶2∶3（V/V/V），充分混合〕，完全麻醉后置手术台上，75%乙醇消毒背部皮肤，剪开背部靠近脾处皮肤（避免出血），剪开腹膜，脾内注射HCT116细胞（1× 106，100μL）。用带线缝合针逐层缝合腹膜和皮肤。16只结直肠癌肝转移模型小鼠分为2组，每组8只，实验组ip给予贝伐珠单抗5 mg·kg-1，对照组ip给予贝伐珠单抗同型对照IgG 5 mg·kg-1，分别于建模前2 d和建模后2 d各给药1次，之后每5 d给药1次，连续给药4周，共计给药7次。给药结束后处死小鼠，取肝组织和肺组织。

1.4 肝、肺器官表面肉眼观察及组织病理检查

给药结束后处死小鼠，取出肝、肺器官，肉眼观察肝、肺表面转移灶；剥离小鼠肝、肺组织，剪取部分浸泡于10%甲醛中固定。按常规操作流程制作石蜡包埋的病理切片，HE染色，光镜下观察组织的病理变化。

1.5 实时定量PCR方法检测肺组织人源CXCR4（hCXCR4）及其配体鼠源CXCL 12（mCXCL12）mRNA表达

剪取、称量50 mg小鼠肺组织，放入匀浆器，加Trizol 1 mL研磨，室温放置5 min，加三氯甲烷200μL，振荡15 s，室温放置10 min，12 000×g，4℃离心10 min，移取上层液体到新的EP管，加入500μL异丙醇，振荡混匀，室温放置10 min，12 000×g，4℃离心10 min，弃上清后加入1 mL 75%乙醇，振荡混匀，7500×g，4℃离心5 min，弃上清。加入10μL水溶解，通过逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA。逆转录体系为20μL：2×逆转录反应混合液10μL；随机引物1μL；逆转录酶混合液1μL；水加mRNA 8μL。使用定量RT-PCR仪进行检测。反应扩增体系为20μL，上下游引物各0.5μL；SYBR GREEN Mix 10μL；水8μL；cDNA 1μL。定量RT-PCR反应条件：预变性95℃，5 min；变性95℃10 s，退火60℃10 s，延伸72℃15 s，收集荧光，反应40个循环；55℃开始每个循环上升0.5℃30 s，收集熔解曲线荧光，反应71个循环。循环结束后，通过熔解曲线检测引物扩增的特异性，以GAPDH为内参，通过公式2-△△Ct计算目的基因的相对表达水平。

Tab.1 RT-PCR primer sequences

1.6 实时定量PCR方法检测HCT116细胞CXCR3，CXCR4和CXCR7 mRNA表达

将HCT116细胞1×105接种于48孔板，400μL完全培养基体系培养，贝伐珠单抗（5 mg·L-1）刺激24 h，收细胞，600×g离心5 min，弃去上清，加1 mL Trizol吹匀。提取总RNA、逆转录和扩增反应条件同1.5。

1.7 Western蛋白印迹法检测HCT116细胞VEGFR1，CXCR4和CXCR 7蛋白表达

将HCT116细胞1×106接种于12孔板，500μL完全培养基体系培养，贝伐珠单抗（5 mg·L-1）刺激24 h，收集细胞，600×g离心5 min，弃去上清，加100μL蛋白裂解液混匀，冰上裂解10 min，加5×上样缓冲液25μL，沸水煮10 min。用Western蛋白印迹法检测VEGFR1，CXCR4和CXCR 7蛋白表达。待测蛋白相对表达水平用待测蛋白与内参蛋白GAPDH电泳条带积分吸光度比值表示待测蛋白相对表达水平。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 贝伐珠单抗对小鼠结直肠癌肝、肺转移的影响

给药结束后处死小鼠，取肝、肺并肉眼观察（图略）发现，对照组和贝伐珠单抗治疗组肝转移小鼠分别为6/8和2/8，肺转移小鼠分别为2/8和8/8；统计分析显示，贝伐珠单抗治疗组肝转移小鼠明显减少（X2=4.1，P＜0.05），肺转移小鼠明显增加（X2=6.67，P＜0.05）。肝组织病理观察结果显示，贝伐珠单抗治疗组小鼠肝病变空灶减少（图1A），肺病变空灶增加（图1B）。表明贝伐珠单抗能够抑制结直肠癌小鼠肝转移灶的形成，促进肺转移灶的形成。

Fig.1 Effect of bevacizumab treatment on liver（A）and lung（B）metastasis in metastatic colorectal cancer model mice（HE staining）.Colorectal liver metastases model was established by injection of HCT116 cells into the spleen of BALB/c-nu recipients.The mice in experimental group were administered ip with bevacizumab 5 mg·kg-1，and the mice in control group were given isotype IgG at the same dosage.The antibodies were administered on 2 d before and after initiation of model establishment respectively，then once every 5 d for 4 weeks，for a totalof7 times.The arrows show metastases.

2.2 贝伐珠单抗促进结直肠癌小鼠肺组织hCXCR4和配体mCXCL12 mRNA的表达

定量RT-PCR检测结果（图2）表明，与对照组比较，贝伐珠单抗治疗组小鼠肺组织中hCXCR4和mCXCL12 mRNA表达显著增加（P＜0.05），表明贝伐珠单抗治疗后能够促进结直肠癌模型小鼠肺组织hCXCR4和mCXCL12的表达。

Fig.2 Effect of bevacizumab treatment on mRNA expression of hCXCR4（A）and mCXCL12（B）in lung tissue of metastatic colorectal cancer model mice detected by quantitative RT- PCR.，n=8. *P＜0.05，compared with isotype IgG group.

2.3 贝伐珠单抗对HCT116细胞VEGFR1，CXCR3，CXCR4及CXCR7表达水平的影响

Western蛋白印迹法和定量RT-PCR结果显示，贝伐珠单抗处理能够明显上调CXCR4和CXCR7 mRNA和蛋白表达，但不影响CXCR3 mRNA表达（图3A和B）。此外，贝伐珠单抗处理能够显著上调HCT116细胞VEGFR1蛋白表达（图3B）。

Fig.3 Effect of bevacizumab on CXCR3/4/7 mRNA expression（A）and CXCR4/7 and vascular endothelial gorwth factor receptor 1（VEGFR1）protein expression（B）in HCT116 cells detected by quantitative RT-PCR and Western blotting，respectively.HCT116 cells（1× 105）were treated with bevacizumab 5 mg·L-1for 24 h.，n=3. *P＜0.05，**P＜0.01，compared with isotype IgG group.

3 讨论

肿瘤的生长需要血管输送大量的氧和营养物质，因此肿瘤血管的生成是肿瘤生长和转移的关键，抑制肿瘤血管形成能够切断肿瘤的营养供应，减缓肿瘤的发展。靶向VEGF抗肿瘤药物的研发使肿瘤患者的生存期明显延长，部分肿瘤患者长期接受抗VEGF/ VEGFR抗肿瘤药物治疗后，会出现不同程度的治疗耐药和复发［5］，这可能与促血管生成因子上调、肿瘤细胞迁移能力增加以及转移灶的出现有关［8］。结直肠癌组织中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的大量分泌，也是VEGF-A表达升高、肿瘤细胞迁移及侵袭能力增加的诱因之一［10］。

本研究发现，采用贝伐珠单抗进行抗VEGF治疗确实能够抑制肿瘤的肝转移，但同时增加了癌细胞向肺部的迁移，这与之前的临床观察发现——长期给予抗VEGF治疗后患者的治疗耐药和肿瘤复发、远端转移相一致［5］。究其原因，推测可能与肿瘤细胞上调趋化因子受体CXCR4和靶器官（肺）中相应配体CXCL12表达升高有关。鉴于mCXCL12能够与hCXCR4/7相结合，启动下游信号［11］，认为肺组织中的CXCL12能够吸引表达CXCR4/7的结直肠癌细胞趋化至肺部，而且该效应可能具有特异性。

为了进一步评价此效应，本研究进行了体外实验。将贝伐珠单抗5 mg·L-1加入HCT116细胞培养24 h。结果显示，贝伐珠单抗处理能够明显上调CXCR4和CXCR7 mRNA和蛋白表达，但不影响CXCR3 mRNA表达。此外，贝伐珠单抗处理能够显著上调HCT116细胞VEGFR1蛋白表达。为此推测，贝伐珠单抗抑制了VEGF-A与其受体VEGFR1/2的结合，导致VEGFR1的表达上调，从而间接增强了与其他配体——血小板源生长因子和VEGF-B的结合，启动下游信号，促进CXCR4/7的表达。确切的作用机制尚需进一步研究。

总之，本研究初步验证了贝伐珠单抗治疗后促进结直肠癌肺转移的副作用，提示联合靶向CXCL12/ CXCR4的小分子化合物或单克隆抗体可能能够抑制贝伐珠单抗引起的肺转移，增强贝伐珠单抗的疗效。

［1］Scagliotti G，Govindan R.Targeting angiogenesis with multitargeted tyrosine kinase inhibitors in the treatmentofnon-smallcelllung cancer［J］.Oncologist，2010，15（5）：436-446.

［2］Grothey A，Allegra C.Antiangiogenesis therapy in the treatment of metastatic colorectal cancer［J］. Ther Adv Med Oncol，2012，4（6）：301-319.

［3］Wu Q，Shi Y，Chen L，Xiao X，Dai G.Effect and safety of bevacizumab-containing chemotherapy treatment in Chinese patients with metastatic colorec⁃talcancer［J］.Onco Targets Ther，2013，6：485-490.

［4］Fischer C，Haque SS，Huse JT，Blochin E，Souweidane MM，Lis E，et al.Extraneuralependy⁃moma：distant bone，lung，liver，and lymph node metastases following bevacizumab［J］.Pediatr Blood Cancer，2013，60（1）：143-145.

［5］Yamagishi N，Teshima-Kondo S，Masuda K，Nishida K，Kuwano Y，Dang DT，et al.Chronic inhibition of tumor cell-derived VEGF enhances the malignant phenotype of colorectal cancer cells［J］.BMC Cancer，2013，13（1）：229.

［6］Duda DG，Kozin SV，Kirkpatrick ND，Xu L，Fukumura D，Jain RK.CXCL12（SDF1alpha）-CXCR4/CXCR7 pathway inhibition：an emerging sensitizer for anticancer therapies？［J］.Clin Cancer Res，2011，17（8）：2074-2080.

［7］Cambien B，Karimdjee BF，Richard-Fiardo P，Bziouech H，Barthel R，Millet MA，et al.Organspecific inhibition of metastatic colon carcinoma by CXCR3 antagonism［J］.Br J Cancer，2009，100（11）：1755-1764.

［8］Gil M，Seshadri M，Komorowski MP，Abrams SI，Kozbor D.Targeting CXCL12/CXCR4 signaling with oncolytic virotherapy disrupts tumor vasculature and inhibits breast cancer metastases［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（14）：E1291-E1300.

［9］Xu L，Duda DG，Di Tomaso E，Ancukiewicz M，Chung DC，Lauwers GY，et al.Direct evidence thatbevacizumab，an anti-VEGF antibody，up-regulates SDF1alpha，CXCR4，CXCL6，and neuropilin 1 in tumors from patients with rectalcancer［J］.Cancer Res，2009，69（20）：7905-7910.

［10］Wang Y，Han G，Wang K，Liu G，Wang R，Xiao H，et al.Tumor-derived GM-CSF promotes inflammatory colon carcinogenesis via stimulating epithelial release ofVEGF［J］.Cancer Res，2014，74（3）：716-726.

［11］Rubie C，Frick VO，Ghadjar P，Wagner M，Justinger C，Faust SK，et al.CXC receptor-4 mRNA silencing abrogates CXCL12-induced migration of colorectalcancercells［J］.J TranslMed，2011，9：22.

Lung metastases of colorectalcancer boosted by bevacizumab in mice and possible mechanism

CHEN Ya-qiong1，LIYuan-yuan2，LYU Zhong-ling2，CHEN Guo-jiang2，PENGHui1，3
（1.College ofPharmacy，China PharmaceuticalUniversity，Nanjing 210009，China；2.Departmentof Immunology，Institute ofBasic MedicalSciences，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China；3.DepartmentofEnvironmentand Pharmacy，Institute of Health and Environmental Medicine，Academy of Military MedicalSciences，Tianjin 300050，China）

OBJECTIVE To investigate the effect of bevacizumab，an anti-human vascular endothelial growth factor monoclonal antibody，on pulmonary dissemination of colorectal cancer.METHODS A metastatic colorectal cancer mouse model was established.Mice were randomly divided into two groups（n=8）.The mice in experimentalgroup were administered ip with bevacizumab at the dosage of 5 mg·kg-1，and those in control group were given isotype IgG at the same dosage.The antibodies were administered on 2 d before initiation of model establishment and 2 d after that，then once every 5 d for 4 weeks，for a totalof 7 times.Liver and lung metastases were determined by histopathologicalexamination. The chemokine receptor C-X-C receptor 4（CXCR4）and its ligand C-X-C ligand 12（CXCL12）mRNA expression in the lung were detected by quantitative RT-PCR.Human colon cancer cells HCT116 were treated with bevacizumab（5 mg·L-1）for 24 h.The expression levels ofvascularendothelialgrowth factor receptor 1（VEGFR1）and CXCR4/7 protein as wellas CXCR3/4/7 mRNA were examined by Western blotting and quantitative RT-PCR respectively.RESULTS The number of mice（2/8）with liver metastases was reduced，while the number of mice（8/8）with lung metastases increased in experimental group compared with isotype IgG-treated group（6/8 and 2/8 respectively，P＜0.05）.The mRNA expression levelof CXCR4 and CXCL12 in lung tissue was significantly up-regulated in bevacizumab-treated group com⁃pared with controlgroup（P＜0.05）.The mRNA and protein expression levelof CXCR4 and CXCR7 was dramatically increased in HCT116 cells treated with bevacizumab（P＜0.05）.CONCLUSION Bevacizumab can potentially promote lung metastases of colorectalcancer，which may be related to up-regulation of CXCR4 and CXCL12 expression.

bevacizumab；colorectalcancer；metastases；chemokine receptor

The project supported by National Natural Science Foundation of China（81173082）；National Natural Science Foundation of China（81272320）；National Natural Science Foundation of China（81472647）；Beijing Natural Science Foundation（7132151）；and Tianjin Key R&D and Frontier Technology Plan（15JCZDJC34700）

PENG Hui，E-mail：p_h2002@hotmail.com；CHEN Guo-jiang，E-mail：guogangch@yahoo.com

R971.1

A

1000-3002-（2016）05-0564-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.013

2015-10-22接受日期：2016-03-18）

（本文编辑：齐春会）

国家自然科学基金（81173082）；国家自然科学基金（81272320）；国家自然科学基金（81472647）；北京市自然科学基金（7132151）；天津市应用基础与前沿技术研究计划重点项目（15JCZDJC34700）

陈亚琼，女，硕士研究生，主要从事抗肿瘤药理学研究；彭晖，男，研究员，主要从事抗肿瘤药理学研究；陈国江，男，副研究员，主要从事抗肿瘤免疫学研究。

彭晖，E-mail：p_h2002@hotmail.com；陈国江，E-mail：guogangch@yahoo.com