五氯联苯PCB118对人肝癌细胞BEL-7402细胞黏附的影响

梁文丽,宋 莉，李卓玉

（山西大学生物技术研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西太原030006）

五氯联苯PCB118对人肝癌细胞BEL-7402细胞黏附的影响

梁文丽,宋 莉，李卓玉

（山西大学生物技术研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西太原030006）

目的探讨五氯联苯PCB118对人肝癌细胞细胞-基质间和细胞-细胞间黏附的影响和机制。方法人肝癌细胞BEL-7402用PCB118 0.1，1.0和10.0 nmol·L-1分别处理4和6 d后，采用细胞-基质间黏附实验检测细胞-基质间黏附，细胞聚集实验检测细胞间黏附，实时荧光定量PCR法和Western蛋白印迹法检测细胞黏附关键因子CD29、E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白的表达。结果与细胞对照组相比，人肝癌细胞BEL-7402在PCB118 0.1，1.0和10.0 nmol·L-1处理6 d后，细胞-基质间黏附能力明显提高（P＜0.05），细胞-细胞间黏附明显降低（P＜0.05）。实时荧光定量PCR结果显示，PCB118明显提高黏附关键因子CD29和N-钙黏着蛋白mRNA水平（P＜0.05），显著降低E-钙黏着蛋白mRNA水平（P＜0.05）。Western蛋白印迹结果表明，PCB118处理后，CD29和N-钙黏着蛋白的蛋白表达显著升高（P＜0.01），E-钙黏着蛋白的蛋白表达显著降低（P＜0.01）。结论PCB118影响肝癌细胞黏附并改变黏附因子CD29、E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白的表达，这可能与PCB118促进肝癌的发展有关。

多氯联苯；肝癌；细胞-基质间黏附；细胞间黏附

多氯联苯（polychlorinated diphenyls，PCB）是一类人工合成的氯代芳烃类化合物，由于其良好的化学稳定性而广泛应用于塑料加工业、电力工业、化工业和印刷业等各种生产领域。研究发现，PCB是典型的持久性有机污染物，具有持久性、长距离迁移力和生物富集性，已造成全球性污染［1］。PCB主要通过食物消耗和直接接触暴露于人体，并对人类健康造成严重威胁［2］。据报道，PCB与多种健康风险相关，包括内分泌系统紊乱、心血管疾病、神经系统发育毒性、生殖毒性、免疫毒性以及糖尿病等［3-5］。更严重的是，PCB与多种肿瘤发生密切相关，包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和精巢癌等［6-8］。

近年来，肝癌的发病率和病死率有逐渐升高的趋势。国际癌症研究中心数据表明，2012年全球＞50%新发肝癌病例和死亡病例发生在中国。肝癌的发生与多种危险因素密切相关，包括肝炎病毒感染、黄曲霉素和乙醇等。流行病学调查和动物实验表明，肝癌的患病风险与PCB暴露密切相关［9-13］，但PCB暴露促进肝癌发病的分子机制并不清楚。细胞黏附涉及细胞-基质间黏附和细胞间黏附，在恶性肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用，其破坏是启动转移的关键［14］。PCB种类繁多，其中以PCB118最具代表性，是用于评估环境中总PCB的直接指标。目前，关于PCB118暴露对肝癌细胞黏附的影响及分子机制未见报道。本研究旨在探讨PCB118暴露对人肝癌细胞BEL-7402细胞-基质间黏附和细胞间黏附能力的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

五氯联苯PCB118购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清和实时荧光定量PCR试剂盒购自中国上海生工公司；二甲亚砜（DMSO）、胰蛋白酶和大鼠抗人α-微管蛋白一抗购自美国Sigma公司；Trizol和逆转录试剂购自日本TaKaRa公司；结晶紫染色液购自碧云天公司；CD29抗体购自美国BDBiosciences公司；兔抗人E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白一抗购自美国Bioworld公司；HRP标记羊抗鼠IgG（H+L）和羊抗兔IgG（H+L）购自美国Invitrogen公司；CO2细胞恒温培养箱购自美国Thermo Forma公司；显微镜购自日本Olympus公司；Infinite F50酶标仪购自瑞士TECAN公司；蛋白质电泳仪和电转仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养和药物配制

人肝癌细胞株BEL-7402由本实验室保存。细胞为贴壁细胞，用含10%胎牛血清，1%青、链霉素的RPMI1640培养基置于37°C，5%CO2的CO2细胞培养箱中培养。当细胞生长到约80%，采用胰酶消化细胞并传代，取对数生长期细胞进行实验。

将PCB118溶于DMSO，配成100 mmol·L-1储备液。使用时用RPMI1640培养基稀释至各个实验浓度，空白对照组用0.1%DMSO。

1.3 细胞-基质间黏附实验检测细胞-基质间黏附率

人肝癌细胞BEL-7402按每孔2×105细胞接种于6孔培养板中，细胞培养箱中培养24 h后，用浓度为0.1，1.0和10.0 nmol·L-1的PCB118分别处理4和6 d，在培养期间，每隔2 d换液并重新加药。4或6 d后，收集细胞并调整密度，按每孔1×104细胞接种于96孔培养板中。随后置于培养箱中分别培养0.5，1，1.5和2 h后吸出各孔培养基，PBS缓冲液洗涤细胞2次。每孔加入50μL冰冻甲醇室温固定。20 min后，用PBS缓冲液洗涤细胞，加入50μL 0.5%结晶紫染色液室温染色20 min，然后用PBS缓冲液洗涤细胞，再加入50μL 1%SDS溶解。室温孵育10 min后，于酶标仪570 nm波长下测定吸光值（A）。实验重复3次。细胞-基质间黏附率（%）=实验组A570nm/对照组A570nm×100%。

1.4 细胞聚集实验检测细胞间黏附率

PCB118 0.1，1.0和10.0 nmol·L-1分别处理人肝癌细胞BEL-7402 4和6 d，在培养期间，每隔2 d换液并重新加药。4或6 d后，按每孔5×105细胞接种于96孔培养板。然后置于37°C，转速80次·min-1摇床上振荡1 h。倒置显微镜（20×）下统计细胞与细胞间成团数。实验重复3次。处理组细胞间黏附率（%）=实验组细胞间成团数/细胞对照组细胞间成团数×100%。

1.5 实时荧光定量PCR检测CD29、E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白mRNA表达

人肝癌细胞BEL-7402按每孔1×105细胞接种于12孔培养板中，PCB118 0.1，1.0和10.0 nmol·L-1分别处理4和6 d，培养期间，每隔2 d换液并重新加药。4或6 d后，收集细胞，按总RNA提取试剂盒说明书提取。然后按逆转录试剂盒说明，将提取的总RNA进行逆转录合成cDNA。按照实时荧光定量PCR试剂盒说明进行PCR。15μL PCR的反应体系如下：4.9μL H2O，2μL cDNA，0.6μL的上游和下游引物和7.5μL SYBR Premix Ex TaqTM。用GAPDH基因对目的基因CD29、E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白mRNA表达进行均一化处理。基因表达变化的计算采用倍增变化率，基因倍增变化率=2-△△Ct（ΔCt为目的基因和内参照基因Ct值的差值）。PCR反应引物如表1。

Tab.1 Primer sequences of CD29，E-cadherin，N-cadherin and GAPDH for real-time quantitative PCR

1.6 Western蛋白印迹法检测CD29、E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白表达

人肝癌细胞BEL-7402按每孔1×106细胞接种于60 mm培养皿中，用PCB118 0.1，1.0和10.0 nmol·L-1处理6 d，在培养期间，每隔2 d换液并重新加药。6 d后，收集细胞，加入细胞裂解液裂解10 min，13 000×g，4°C离心10 min，收集上清。BCA法测蛋白浓度。加入5×SDS蛋白上样缓冲液，100°C金属浴5 min后，进行10%SDS-PAGE凝胶电泳。电泳后，分离的蛋白条带转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后，4°C一抗孵育过夜，TBST洗膜2次。然后加入二抗室温孵育1 h，TBST洗膜2次。最后于暗室化学发光液显像。使用Image J分析软件对蛋白条带进行积分吸光度分析，以目标蛋白条带的积分吸光度值与对应的α-微管蛋白积分吸光度值的比值表示目标蛋白的相对表达水平。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 PCB118对人肝癌细胞BEL-7402细胞-基质间黏附的影响

与细胞对照组相比，PCB118 0.1，1.0和10.0 nmol·L-1处理人肝癌细胞BEL-7402 4 d后，细胞-基质间黏附未发生明显变化。表2显示，当不同浓度的PCB118处理人肝癌细胞BEL-7402 6 d后，细胞-基质间黏附率增大。与细胞对照组相比，PCB118 0.1，1.0和10.0 nmol·L-1处理明显提高BEL-7402细胞-基质间黏附能力（P＜0.05）。

Tab.2 Effect of PCB118 exposure on cell-matrix adhesion of human hepatoma cells BEL-7402

2.2 PCB118对人肝癌细胞BEL-7402细胞间黏附的影响

PCB118 0.1，1.0和10.0 nmol·L-1处理人肝癌细胞BEL-7402 4 d后，与细胞对照组相比，细胞间黏附未发生明显变化。当不同浓度的PCB118处理人肝癌细胞BEL-7402 6 d后，细胞间黏附率降低。与细胞对照组相比，PCB118 0.1，1.0和10.0 nmol·L-1处理明显降低BEL-7402细胞间黏附能力，细胞间黏附率分别降低了（20.0±5.2）%，（26.8±4.8）%和（20.9±7.7）%（P＜0.05）（图1）。

Fig.1 Effect of PCB118 exposure on cell-cell adhesion of human hepatoma cells BEL-7402.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with controlgroup.

2.3 PCB 118对人肝癌细胞BEL-7402细胞黏附因子CD29、E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白基因表达的影响

实时荧光定量PCR（图2）结果显示，与细胞对照组相比，PCB118 0.1，1.0和10 nmol·L-1处理人肝癌细胞BEL-7402 4 d后，黏附因子CD29，E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白的mRNA相对表达均无明显变化；处理6 d后，CD29 mRNA水平分别是细胞对照组的1.4±0.1，1.8±0.2和（1.7±0.1）倍（P＜0.05）（图2A），E-钙黏着蛋白mRNA水平分别为细胞对照组的（87±9）%，（80±4）%和（80±6）%（图2B），N-钙黏着蛋白mRNA水平分别是细胞对照组的2.2±0.2，2.3±0.3和（2.1±0.3）倍（图2C）。

Fig.2 Effect of PCB118 on relative mRNA expression of CD29（A），E-cadherin（B）and N-cadherin（C）in human hepatoma cells BEL-7402.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with controlgroup.

2.4 PCB118对人肝癌细胞BEL-7402黏附因子CD29、E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白蛋白表达的影响

Western蛋白印迹检测（图3）表明，BEL-7402细胞经PCB1180.1，1.0和10.0nmol·L-1处理6d后，CD29蛋白表达显著升高，分别为细胞对照组的1.5，1.7和1.5倍（P＜0.01）；E-钙黏着蛋白的蛋白表达显著降低，分别为细胞对照组的73.4%，49.3%和51.4%（P＜0.01）；N-钙黏着蛋白的蛋白表达显著升高，分别是细胞对照组的1.4，1.5和1.5倍（P＜0.01）。

3 讨论

本研究结果显示，PCB118暴露能明显提高人肝癌细胞BEL-7402细胞-基质间黏附能力，显著降低细胞间黏附能力，提高黏附关键因子CD29和N-钙黏着蛋白的表达水平，降低E-钙黏着蛋白的表达水平。这些结果提示，PCB118可能通过改变肝癌细胞的黏附能力进而促进肝癌的进展。

细胞的黏附能力在肿瘤的转移过程中扮演了十分关键的角色。在恶性肿瘤转移过程中，同型细胞间黏附能力的降低导致肿瘤细胞从原发瘤上脱落。细胞与细胞外基质间的黏附能力增强使得肿瘤细胞易于游离出基底膜，这一过程是肿瘤浸润和转移的始动步骤。随后，肿瘤细胞经血循环、淋巴道、体腔等到达继发组织器官从而形成相同性质的转移瘤［15］。本研究发现，PCB118暴露人肝癌细胞BEL-74024d后并未对人肝癌细胞BEL-7402的细胞黏附有明显作用，而在暴露6d后明显提高细胞-基质间黏附能力并降低细胞间黏附能力，推测这可能是PCB118对癌细胞的慢性作用结果导致。上述结果表明，PCB118暴露明显改变人肝癌细胞的细胞黏附能力，这一过程可能是PCB118促进肝癌进展的重要机制之一。

细胞黏附因子在调节细胞黏附中发挥重要作用。其中整合素是介导细胞和基质之间连接的细胞表面跨膜受体，主要由α和β亚单位组成异构二聚体。CD29是整合素βl亚单位，介导细胞与细胞外基质黏附作用［16］，其能通过提高细胞与基质黏附进而促进肿瘤细胞的侵袭转移。傅遍红等［17］的实验表明，CD29分子在肝癌细胞株的细胞膜表面具有较强的表达，表达率达95.78%，李兴睿等［18］也证实了整合素β1在肝癌细胞中的阳性表达率显著高于非肝癌组织，CD29可作为判断肝癌恶性程度和侵袭性的重要指标之一。本研究发现，经浓度为0.1，1.0和10.0nmol·L-1的PCB118暴露人肝癌细胞BEL-74024d后，CD29mRNA水平未发生明显改变；而PCB118暴露时间延长至6d，CD29 mRNA和蛋白水平显著升高。这一结果与细胞基-质间黏附实验结果相一致。此外，这些结果提示，PCB118暴露促进人肝癌细胞BEL-7402细胞-基质间黏附能力可能与其提高CD29的表达相关。

E-钙黏着蛋白在维持上皮细胞间黏附中发挥重要作用，其是细胞间黏附的负调节因子［19］。E-钙黏着蛋白能抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。在肿瘤进展中，E-钙黏着蛋白功能缺失引起细胞间黏附能力降低，导致肿瘤细胞发生侵袭和转移。在40%的肝癌样本中观察到E-钙黏着蛋白表达的降低［20］。N-钙黏着蛋白也是一个连接蛋白，并且调节细胞间黏附能力。本研究发现，与细胞间黏附实验结果相一致，PCB118暴露人肝癌细胞BEL-74024d对E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白表达没有明显的影响；当PCB118暴露6d后，E-钙黏着蛋白表达明显降低，而N-钙黏着蛋白的表达明显升高。上述结果表明，PCB118暴露抑制人肝癌细胞BEL-7402细胞间黏附能力可能与其影响E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白的表达相关。此外，E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白也参与上皮-间充质转化（epithelial-mesene⁃hymaltransition，EMT）。EMT改变表现在形态改变、功能改变和表型分子表达改变，其中E-钙黏着蛋白表达减少，N-钙黏着蛋白表达升高是EMT的一个重要机制［21］。因此，PCB118暴露人肝癌细胞BEL-7402后，可能同时影响了肿瘤细胞的上皮-间充质转化。

Fig.3EffectofPCB118onproteinexpressionofCD29，E-cadherinandN-cadherininhumanhepatomacells BEL-7402byWesternblotting.Bwasthesemiquantitative resultofA.*P＜0.05，**P＜0.01，comparedwithcontrol group.

综上所述，PCB118暴露明显影响人肝癌细胞BEL-7402细胞黏附能力，并改变黏附关键因子CD29、N-钙黏着蛋白和E-钙黏着蛋白的表达水平，这可能是PCB118促进肝癌进展的重要机制之一。

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Effect of PCB118 on celladhesion of human hepatocellular carcinoma cells BEL-7402

LIANG Wen-li，SONG Li，LIZhuo-yu
（Key Laboratory of ChemicalBiology and Molecular Engineering of the Ministry of Education，Institute of Biotechnology，ShanxiUniversity，Taiyuan 030006，China）

OBJECTIVE To investigate the effects and mechanism of PCB118 on cell-matrix and cell-celladhesion in human hepatocellular carcinoma cells.METHODS Human hepatocellular carcinoma cells BEL-7402 were treated with PCB118 0.1，1.0 and 10.0 nmol·L-1for 4 or 6 d，respectively.Then the cell-matrix adhesion assay and cell aggregation experiments were conducted to study the effect of PCB118 on cell-matrix adhesion and cell-celladhesion in BEL-7402 cells.Quantitative real-time PCR and Western blotting methods were employed to assess the expression of key cytokines CD29，N-cadherin and E-cadherin.RESULTS The results showed that the cell-matrix adhesion ability ofhuman hepato⁃cellular carcinoma cells BEL-7402 were significantly increased（P＜0.05）after treatment with PCB118 0.1，1.0 and 10.0 nmol·L-1for 6 d，whereas the cell-celladhesion ability was significantly reduced（P＜0.05）.Exposure to PCB118（0.1，1.0 and 10.0 nmol·L-1）for 6 d induced significantupregulation ofthe mRNA expression levels of CD29 and N-cadherin along with the downregulation of E-cadherin（P＜0.05）. Western blotting analysis revealed that PCB118 exposure significantly increased protein expressions of CD29 and N-cadherin but reduced E-cadherin protein level（P＜0.01）.CONCLUSION PCB118 exposure affects the expression of CD29，N-cadherin and E-cadherin，which may be involved in PCB118-induced alteration ofcelladhesion ofhepatocellular carcinoma cellline BEL-7402.

polychlorinated diphenyls；hepatocellular carcinoma；cell-matrix adhesion；cell-cell adhesion

The project supported by National Natural Science Foundation of China（21207084）；National Natural Science Foundation of China（31271516）；and Natural Science Foundation of Shanxi Province（2014011027-5）

SONG Li，E-mail：lsong@sxu.edu.cn，Tel：（0351）7017774

R114

A

1000-3002-（2016）05-0558-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.012

2015-09-27接受日期：2016-02-25）

（本文编辑：乔 虹）

国家自然科学基金（21207084）；国家自然科学基金（31271516）；山西省自然科学基金（2014011027-5）

梁文丽，女，硕士研究生，主要从事环境毒理学研究。

宋莉，E-mail：lsong@sxu.edu.cn，Tel：（0351）7017774