不同浓度褪黑素对人骨肉瘤MG⁃63细胞增殖的影响

刘立峰，李侠，潘玉涛，陈涤，刘养洲，普星宇，王喆，李增春

（同济大学附属东方医院创伤骨科，上海 200120）

不同浓度褪黑素对人骨肉瘤MG⁃63细胞增殖的影响

刘立峰，李侠，潘玉涛，陈涤，刘养洲，普星宇，王喆，李增春

（同济大学附属东方医院创伤骨科，上海 200120）

目的检测不同浓度褪黑素对体外培养的人骨肉瘤细胞系MG⁃63细胞增殖的影响，为更好地应用褪黑素辅助治疗骨科疾病提供一定的实验基础。方法在体外培养的MG⁃63细胞中，外源性加入1 nmol/L～10 mmol/L浓度褪黑素，用CCK⁃8的方法检测不同浓度褪黑素对细胞增殖的影响，用PI染色流式细胞术检测其对细胞周期分布的影响。结果CCK⁃8分析发现4～10 mmol/L浓度的褪黑素可以以一种时间依赖性和剂量依赖性的方式显著抑制MG⁃63细胞的增殖，而1 nmol/L～2 mmol/L浓度的褪黑素对MG⁃63细胞的增殖没有显著影响。无论将MG⁃63细胞周期同步还是非同步，流式细胞仪的检测显示，4～10 mmol/L浓度褪黑素可以显著增加细胞周期G0/G1期的比例，同时减少S和G2/M期的比例；而1 nmol/L～2 mmol/L浓度褪黑素对MG⁃63细胞周期的分布没有显著影响。结论褪黑素可以以一种时间依赖性和剂量依赖性方式抑制骨肉瘤MG⁃63细胞的增殖，这种抑制效应与细胞周期分布的改变和G0/G1期停滞有关。

褪黑素；骨肉瘤；增殖；细胞周期

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骨肉瘤是一种最常见的原发恶性骨肿瘤。研究［1⁃2］显示骨肉瘤的发生发展与青春期骨骼的快速生长和骨骼的成熟度密切相关。褪黑素是一种主要由松果体合成分泌的激素［3］，骨的代谢与体内褪黑素水平密切相关［4］，对成骨细胞和破骨细胞都具有调节作用［5⁃7］，骨髓细胞也可以从头合成［8］。已经发现褪黑素在许多肿瘤细胞中具有抗肿瘤效应［9］，但PANZER等［10］认为褪黑素的抗肿瘤效应与细胞类型有关，对骨肉瘤细胞无效，鉴于褪黑素具有无毒、能增强许多化疗药物的抗肿瘤效应和减少化疗药物的毒副反应的特性［11］，故研究单独应用褪黑素或者联合其他化疗药物治疗骨肉瘤具有重要的理论和实践意义。本研究的目的是检测不同浓度褪黑素对人骨肉瘤MG⁃63细胞增殖的影响，探讨褪黑素是否具有抑制人骨肉瘤MG⁃63细胞增殖的能力，为更好地应用褪黑素辅助治疗骨肉瘤等疾病提供一定的理论和实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

人类骨肉瘤MG⁃63细胞系被培育在添加10%胎牛血清（HyClone公司）的DMEM培养基（Gibco公司）中，在含有5%CO2和37℃的条件下培养，每隔1 d更换1次培养基。MG⁃63细胞以104/cm2的密度接种到培养皿中，24 h后用于后续实验。褪黑素的母液用含有100%的DMSO（Sigma公司）制备，随后根据待检测的浓度用培养基做1个梯度稀释；在最后检测时，保证对照组和实验组的培养基中含有相同浓度的0.2%DMSO和10%胎牛血清。褪黑素和CCK⁃8试剂盒购买于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1细胞增殖分析：用CCK⁃8染色的方法检测不同浓度褪黑素对骨肉瘤MG⁃63细胞增殖的影响。将MG⁃63细胞以4 000个/孔的密度接种到96孔板上，24 h后培养基换成含有1 nmol/L～10 mmol/L浓度褪黑素的培养基（对照组换成含有0.2%DMSO的培养基），再分别培养24 h、48 h和72 h。然后根据说明书指示，每孔加入20 μL的CCK⁃8溶液，并设立空白对照组（加了相应量细胞培养液、褪黑素和CCK⁃8溶液但没有加入细胞的孔），在细胞培养箱内继续孵育2 h，然后在450 nm测定吸光度。数据以对照组细胞OD值的百分比表示。

1.2.2细胞周期分析：将MG⁃63细胞以1×105/孔的密度接种到6孔板上，24 h后培养基被换成含有1 nmol/L～10 mmol/L浓度褪黑素的培养基（对照组换成含有相同0.2%DMSO的培养基），再培养24 h。然后细胞用胰酶消化离心，用冰冷的PBS溶液冲洗2次，固定在75%乙醇中，4℃条件下过夜。过夜后，细胞再次用PBS漂洗，悬浮在0.5 mL的PBS溶液中（还含有100 μg/mL PI、0.1%Triton X⁃100、0.003 7% EDTA和0.2 mg/mL DNase⁃free RNase），样品在避光下室温放置30 min，随后每10 000个细胞进行流式细胞仪检测，用Modfit LT 3.0软件（BD公司）检测样品中G0/G1、S和G2/M期细胞的比例。

1.3统计学分析

应用SPSS 16.0软件进行数据分析。双因素方差分析用来评价褪黑素的剂量、暴露的时间和二者之间的相互作用造成的不同是否有意义，Bonferroni检验和Dunnett T3检验用来评价随后的两两比较，polynomial contrast用来进行趋势分析。单因素方差分析用来评价各个处理组之间的不同是否有意义。所有的数据用至少3次独立实验的x±s表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1不同浓度褪黑素对增殖的影响

用CCK⁃8染色的方法检测不同浓度（1 nmol/L～10 mmol/L）褪黑素对骨肉瘤MG⁃63细胞增殖的影响。褪黑素在MG⁃63细胞上诱导了一种剂量依赖性和时间依赖性的抗增殖效应，这种效应与二者的相互作用有关（P均＜0.01），见图1。

图1　不同浓度褪黑素对骨肉瘤MG⁃63细胞增殖的影响Fig.1　Effect of melatonin at various concentrations on the MG⁃63 cell proliferation

在4～10 mmol/L浓度时，褪黑素显著地抑制了骨肉瘤MG⁃63细胞的增殖（双因素方差分析为所有P＜0.01。单因素方差分析为24 h，所有P＜0.05；48 h，所有P＜0.01；72 h，所有P＜0.05），而1 mmol/L和2 mmol/L浓度褪黑素轻微的抑制了骨肉瘤MG⁃63细胞的增殖（双因素方差分析为1 mmol/L，P=0.748；2 mmol/L，P=0.113。单因素方差分析为24 h，1 mmol/L，P=0.135，2 mmol/L，P=0.110；48 h，1 mmol/L，P= 0.301，2 mmol/L，P=0.112；72 h，1 mmol/L，P=0.181，2 mmol/L，P=0.071）。

1 nmol/L～100 μmol/L浓度的褪黑素对骨肉瘤MG⁃63细胞的增殖没有影响（P均＞0.05）。在检测的24 h与48 h和72 h时间点之间，MG⁃63细胞的增殖表现出一种显著的差异（P均＜0.05），且随着细胞暴露到褪黑素时间的增加，其抑制效应增强（P＜0.01）。

2.2细胞周期非同步时不同浓度褪黑素对细胞周期分布的影响

为了检测褪黑素在细胞增殖上的影响是否与细胞周期分布的改变有一定关系，本研究用流式细胞术检测了MG⁃63细胞周期的分布情况。流式细胞仪分析显示，在细胞暴露到不同浓度的褪黑素24 h以后，与对照组细胞相比，4～10 mmol/L浓度的褪黑素显著地增加了细胞周期中G0/G1期细胞的比例，而同时减少了S期和G2/M期细胞的比例（P均＜0.01）。此外，1～2 mmol/L浓度的褪黑素诱导了一种抑制细胞周期进展效应，但是这种效应差异无统计学意义，见图2。此外，1 nmol/L～100 μmol/L浓度的褪黑素对骨肉瘤细胞周期的分布没有影响。

图2　不同浓度褪黑素在未同步化的骨肉瘤MG⁃63细胞周期分布上的影响Fig.2　Effect of melatonin at various concentrations on cell cycle distribution in the unsynchronized MG⁃63 cells

2.3细胞周期同步后不同浓度褪黑素对细胞周期分布的影响

为了更好地观察不同浓度褪黑素对人骨肉瘤MG⁃63细胞增殖的影响，本研究把人骨肉瘤细胞通过无血清培养36～48 h，使MG⁃63细胞被同步到G0期，再重复上述实验后发现，上述的变化更明显，见图3。

图3　不同浓度褪黑素在同步化的骨肉瘤MG⁃63细胞周期分布上的影响Fig.3　Effect of melatonin at various concentrations on cell cycle distribution in the synchronized MG⁃63 cells

3　讨论

褪黑素可以在许多生物调节过程中发挥作用，如生物周期节律、睡眠、衰老、生殖、骨生理和肿瘤的生长等［12］。越来越多的证据显示，褪黑素水平的下降与肿瘤的发生、发展和恶化密切相关。另外，褪黑素可以减缓化疗药物所诱导的无力、口腔炎、神经毒性和心脏毒性等副作用。1个随机对照的meta分析［11］指出，褪黑素作为一种辅助治疗可以明显延缓肿瘤的进展、提高1年生存率和减缓放化疗所引起的副反应。研究［1⁃4］显示，体内褪黑素水平的下降可能是引起骨肉瘤发生和发展的原因之一。但有研究［10］已经指出，褪黑素对骨肉瘤MG⁃63细胞的生长、形态和细胞周期分布没有影响。本研究发现虽然1 nmol/L～2 mmol/L浓度的褪黑素不能有效地抑制骨肉瘤MG⁃63细胞的增殖，但4～10 mmol/L浓度的褪黑素可以显著地诱导细胞周期停滞。本研究的结果指出了探索用褪黑素辅助治疗骨肉瘤的可能性。

与先前研究［10］一致的是，1 nmol/L～10 μmol/L浓度的褪黑素没有显著影响骨肉瘤MG⁃63细胞的生长和细胞周期的分布；而4mmol/L～10 mmol/L浓度的褪黑素对骨肉瘤MG⁃63细胞诱导了一种显著的剂量依赖性和时间依赖性抑制效应，表明褪黑素具有抑制骨肉瘤细胞增殖的能力，与其使用的浓度有关。关于引起这种有趣现象的原因，笔者认为当褪黑素的浓度达到某个阈值时，一些潜在的信号通路被激活，导致骨肉瘤MG⁃63细胞增殖被抑制。褪黑素的这种抑制骨肉瘤MG⁃63细胞增殖的可能潜在机制是值得进一步深入研究的。

1 mmol/L浓度的褪黑素诱导了正常成骨细胞系hFOB 1.19细胞周期的停滞［5］，但是没有显著地抑制骨肉瘤MG⁃63细胞的增殖，表明在正常成骨细胞和异常成骨细胞之间有显著的不同。引起这种现象的原因目前还不清楚，值得进一步研究。

本研究发现4 mmol/L浓度的褪黑素可以通过调控细胞周期的G0/G1、S和G2/M期的分布诱导细胞周期停滞。同样，当细胞暴露到4 mmol/L及更高浓度的褪黑素中，G0/G1期细胞的比例被明显地增加，而S和G2/M期细胞的比例被相应减少。

本研究结果表明，褪黑素具有抑制骨肉瘤MG⁃63细胞增殖的能力。褪黑素对某些肿瘤细胞没有抑制作用的原因可能是由于其使用的浓度不恰当。因此，褪黑素的抗肿瘤效应很大程度上取决于其使用浓度，并且更高浓度的褪黑素也应该在其他肿瘤细胞中被检测。

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（编辑于溪）

Influence of Melatonin at Different Concentrations on Cell Proliferation in Human MG⁃63 Osteosarcoma Cells

LIU Lifeng，LI Xia，PAN Yutao，CHEN Di，LIU Yangzhou，PU Xingyu，WANG Zhe，LI Zengchun

（Department of Trauma Orthopaedics，Shanghai East Hospital，Tongji University School of Medicine，Shanghai 200120，China）

ObjectiveTo investigate the in vitro effect of melatonin at various concentrations on cell proliferation in human MG⁃63 osteosarcoma cells，so as to provide an experimental basis for the better application of melatonin in the treatment of diseases in Department of orthopedics.Meth⁃odsMelatonin at 1 nmol/L⁃10 mmol/L concentrations was exogenously added to in vitro cultured MG⁃63 cells，and the CCK⁃8 method was used to analyze the effect of melatonin at various concentrations on cell proliferation and flow cytometry with PI staining was used to detect their effect on cell cycle distribution.ResultsCCK⁃8 analysis indicated that melatonin at 4⁃10 mmol/L significantly inhibited the proliferation of MG⁃63 cells in a time⁃and dose⁃dependent manner，and melatonin at 1 nmol/L⁃2 mmol/L has no significant action on the proliferation of MG⁃63 cells.Flow cytom⁃etry assay showed that melatonin at 4⁃10 mmol/L significantly increased the proportion of G0/G1phase of the cell cycle while simultaneously re⁃duced the proportion of the G2/M and S phases；however，melatonin at 1 nmol/L⁃2 mmol/L has no significant effect on MG⁃63 cell cycle distribution regardless after MG⁃63 cell cycle synchronization or non⁃synchronization.ConclusionMelatonin can inhibit the proliferation of MG⁃63 cells in a time⁃dependent and dose⁃dependent manner，which is related to the change of cell cycle and the G0/G1phase arrest of cell cycle.

melatonin；osteosarcoma；proliferation；cell cycle

R816.8

A

0258-4646（2016）11-1017-05

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.11.014

上海市浦东新区卫生系统优秀青年医学人才培养（PWRq2013⁃15）；上海市卫生局面上项目（20134212）；同济大学青年优秀人才培养行动计划（1507219028）

刘立峰（1978-），男，讲师，博士.

李增春，E-mail：drlizc@163.com

2016-04-27

网络出版时间：