HPLC-ELSD法测定新疆药桑叶中1-脱氧野尻霉素的含量

王贺，张贵会，杨玲

（塔里木大学生命科学学院，塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆阿拉尔市843300）

HPLC-ELSD法测定新疆药桑叶中1-脱氧野尻霉素的含量

王贺，张贵会，杨玲*

（塔里木大学生命科学学院，塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆阿拉尔市843300）

该研究采用高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)法测定新疆药桑叶中1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)的含量，色谱柱为Waters XBridgeTMHILIC(2.1 mm×100 mm,5 μm)，乙腈-水(85∶15,V/V)为流动相，流速0.2 mL/min。结果表明，1-DNJ在1.2～12.0 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好，平均回收率为98.25%，相对标准偏差(RSD)为1.16%。该方法快捷简便、结果可靠，可用于药桑叶中1-脱氧野尻霉素含量的分析检测。

药桑叶；1-脱氧野尻霉素；高效液相色谱-蒸发光散射检测法；测定

新疆药桑在植物分类学上属桑科（Moraceac）桑属（MorusL.）黑桑种（Morus nigraL.），主要分布在新疆的南疆地区，由于该地域独特的生态环境形成了极为罕见的22倍染色体的独有的桑树资源[1-2]。药桑叶是成熟药桑树的叶片，《本草纲目》中记载：桑叶“汁煎代茗，能止消渴”、“灸熟煎饮，代茶止渴”，历代医学古籍都有记载桑叶治疗消渴症的描述，消渴症即是现代医学俗称的糖尿病。现代药理研究表明，桑叶具有降血糖的作用，其降血糖活性成分为多羟基生物碱[3-4]，其中主要成分为1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin,1-DNJ），化学名称为3,4,5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，分子式C6H13NO4，分子质量为163。1-DNJ是一种天然糖的结构类似物，极性很大，因结构与糖非常类似，能够竞争性的抑制二糖与α-葡萄糖苷酶的结合，阻止麦芽糖、异麦芽糖、蔗糖等二糖水解为单糖被人体吸收，从而明显降低餐后血糖浓度峰值，因此能用于治疗II型糖尿病[5-7]、肥胖症等疾病。并且其还具有抗病毒及抗艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）[8-9]、抗肿瘤转移等作用[10]，高效低毒，有优越的保健食用及药用价值。

蒸发光散射检测器（evaporativelightscatteringdetector，ELSD）是通用的高效液相色谱（high perfarmance liquid chromatography，HPLC）质量检测器，可以直接检测无紫外吸收或荧光官能团物质。1-DNJ是一种不带发色基团的小分子含氮化合物，含有大量羟基亲水集团，在反相色谱柱上保留时间短。目前多利用荧光试剂芴甲氧羰酰氯（fluo renylmethyl chloroformate，FMOC-Cl）进行柱前衍生[11-13]，由于桑叶1-DNJ提取液为淡黄色溶液，少量颜色的存在一定程度上会对溶液的吸光度产生影响，而柱前衍生化操作繁琐，需要严格控制衍生化条件，成本较高。所以本研究采用高效液相色谱法对新疆药桑叶中1-DNJ进行分析检测，旨在为新疆药桑资源的开发利用提供参考依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

新疆药桑叶：2014年7月20号采自新疆库车地区。采后自然晾干后粉碎，过100目筛于干燥处保存，备用。

1-DNJ对照品（纯度98%）：成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈（色谱纯）：迪马科技有限公司；纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司；732型阳离子交换树脂：山海山浦化工有限公司；无水乙醇、NaOH（分析纯）：天津致远化学试剂有限公司；HCl（分析纯）：四川西陇化工有限公司。

1.2仪器与设备

Waters 2695高效液相色谱仪、Waters 2424型蒸发光散射检测器（ELSD）：美国Waters公司；Agilent Technologies 6410 Triple QuadL c/Ms三重四级杆质谱仪（配有Agilent Technologies高效液相色谱系统）：美国安捷伦公司。

1.3方法

1.3.1树脂处理

732型阳离子树脂用体积分数为95%的乙醇溶液反复浸泡洗涤至洗出液澄清，无异味，再分别用2 mol/L HCl溶液浸泡4 h，水洗至中性，2 mol/L NaOH溶液浸泡4 h，水洗至中性，2 mol/L HCl溶液浸泡4 h，水洗至中性备用。

1.3.2溶液的制备

1-DNJ对照品溶液的制备：精密称取1-DNJ对照品1mg，用乙腈-水（50∶50，V/V）溶液溶解并定容至10 mL容量瓶，摇匀，即得质量浓度为100 μg/mL 1-DNJ对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密称取药桑叶1.000 0 g，参考刘一衡等[14]的方法提取，用20 mL体积分数为60%的乙醇溶液，超声功率800 W，温度60℃提取20 min，提取液浓缩至10 mL，加入3倍体积的体积分数为80%的乙醇，4℃静置过夜，5 000 r/min离心10 min除去沉淀，上清液浓缩除去乙醇后，溶于10 mL水中，过732阳离子交换树脂，以0.5 mol/L的氨水洗脱，洗脱液减压浓缩，用乙腈-水（50∶50，V/V）溶液定容于5 mL容量瓶中，作为供试品溶液。临用前溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤后进样。

1.3.3色谱检测条件

HPLC条件：色谱柱为WatersXBridgeTMHILIC（2.1mm× 100 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（85∶15，V/V）；流速：0.2 mL/min；柱温：30℃；ELSD漂移管温度52℃；氮气压力：40 psi；增益：60；喷雾器模式：冷却；进样量：10 μL。

2　结果与分析

2.1对照品和样品中1-DNJ的HPLC色谱图

采用HPLC-ELSD法分别对1-DNJ对照品溶液和供试品溶液按照色谱条件下进行检测，所得HPLC色谱图如图1所示。

因1-DNJ含有较多羟基，且均为氨基糖类，此类化合物在C18柱上保留差，本实验选用Waters XBridgeTMHILIC（2.1 mm×100 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-水系统对色谱条件进行了优化。由图1可知，1-脱氧野尻霉素的峰形良好且达到完全分离。结果表明样品中1-DNJ与对照品保留时间一致，说明桑叶中含有1-DNJ。

2.2线性关系的考察

取100 μg/mL的1-DNJ对照品溶液，用乙腈-水（50∶50，V/V）稀释成质量浓度为1.2 μg/mL、2.4 μg/mL、4.8 μg/mL、9.6μg/mL、12.0μg/mL，取各质量浓度溶液，依次进样10μL，按1.3.3色谱条件进行测定。以1-DNJ对照品峰面积（Y）为纵坐标，以1-DNJ对照品质量浓度（X）为横坐标，进行线性加权回归，权重系数为1/X，得1-DNJ对照品的线性回归方程为：Y=3 327 031.944X-2 617 168.667（R2=0.999 01），结果在1.2～12.0 μg/mL质量浓度范围内，1-DNJ质量浓度和峰面积线性关系良好。

2.3灵敏度试验

取1-DNJ对照品溶液，稀释制成一系列的溶液作为供试品溶液，进行高效液相色谱分析，最终确定1-DNJ质量浓度0.2 μg/μL。分别进样2 μL、4 μL、5 μL、8 μL和10 μL进行高效液相色谱分析，根据高效液相色谱图分析可知进样量为5 μL时峰形较好，所以本实验确定1-DNJ最低检测量为1 μg/mL。

2.4精密度试验

取质量浓度为100 μg/mL的1-DNJ对照品溶液，按1.3.3色谱条件进行测定，连续进样5次（n=5），每次10 μL，记录1-DNJ对照品色谱峰面积，结果见表1。由表1可知，5组平行试验峰面积平均值为17 740 900，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.76%，表明本方法的精密度良好。

表1　精密度试验结果Table 1 Results of precision experiments

2.5稳定性试验

精密称量药桑叶粉末适量，按1.3.2的制备方法制得供试品溶液，放置0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，每次进样10 μL，分别进行测定，记录峰面积，结果见表2。由表2可知，1-DNJ色谱峰面积的RSD为2.51%，表明供试品溶液在室温条件下放置10 h内稳定。

表2　稳定性试验结果（n=5）Table 2 Results of stability experiments（n=5）

2.6重现性试验

取同一批药桑叶样品，精密称取5份，按1.3.2的制备方法制得供试品溶液，按1.3.3色谱条件进行测定，结果见表3。由表3可知，进行5次平行试验测得样品中1-DNJ的平均含量为1.95 mg/g，RSD为2.68%。表明本方法的重复性良好。

表3　重复性试验结果（n=5）Table 3 Results of repeatability experiments（n=5）

2.7回收率试验

精密量取已测知含量的药桑叶样品5份，分别加入1-DNJ对照品粉末，按1.3.2制备方法制得供试品溶液，取10 μL进样，按1.3.3色谱条件进行测定，结果（见表4）可知，1-DNJ在1.30～1.60 mg/g添加范围内的平均回收率为98.25%，RSD为1.16%。

表4　 1-脱氧野尻霉素加标回收率试验结果Table 4 Results of adding standard recovery rate experiments of 1-DNJ

2.8样品测定

取桑叶1.0000g按1.3.2的制备方法制得供试品溶液，分别进样10 μL，按1.3.3色谱条件进行测定，结果如表5所示。

表5　药桑叶中1-脱氧野尻霉素含量测定结果Table 5 Determination results of 1-DNJ contents inMorus nigra L.leaves

由表5可知，本批次药桑叶中1-脱氧野尻霉素平均含量为1.93 mg/g，RSD为1.80%。买买提依明]等[19测定药桑叶中1-脱氧野尻霉素的含量为1.89 mg/g，本实验测试结果稍高的原因可能是采用732型阳离子交换树脂处理样品，主成分经过了富集，消除了其他杂质的干扰，能更好地进行测定。

3　结论

本研究采用HPLC-ELSD法测定新疆药桑叶中1-脱氧野尻霉素的含量。精密度试验、稳定性试验、重现性试验、加样回收率试验的RSD均在合理范围内，方法快捷简便、结果可靠，具有较高的精密度和准确性。成熟药桑叶中1-脱氧野尻霉素平均含量为1.93 mg/g。该方法适用于药桑叶中1-脱氧野尻霉素含量的分析检测，也可用于其他具有类似结构的化合物的分析测定，为该类型化合物的质量控制方法提供依据；也为新疆药桑资源的开发利用提供理论参考依据。

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Determination of 1-deoxynojirinycin content inMorus nigraL.leaves from Xinjiang by HPLC-ELSD

WANG He,ZHANG Guihui,YANG Ling*
(Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, College of Life Science,Tarim University,Alaer 843300,China)

Using the Waters XBridgeTM HILIC(2.1 mm×100 mm,5 μm)as the chromatographic column,acetonitrile-water(85∶15,V/V)as mobile phase,flow rate 0.2 ml/min,the content of 1-deoxynojirimycin(1-DNJ)inMorus nigraL.leaves from Xinjiang was determined by HPLC-ELSD.The results showed that 1-DNJ had a good linear relationship in the range of 1.2-12.0 μg/ml.The average recovery rate and relative standard deviation were 98.25%and 1.16%,respectively.The method was simple,fast and reliable,which could be useful to detect the content of 1-deoxynojirimycin in M.nigraL.leaves.

Morus nigraL.leaves;1-deoxynojirinycin;HPLC-ELSD;determination

O652.63

0254-5071（2016）08-0173-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.039

2016-04-25

国家自然科学基金地区科学基金项目（31460080）；塔里木大学研究生创新项目（TDGRI201519）

王贺（1987-），男，硕士研究生，研究方向为天然产物分子结构与功能研究。

杨玲（1965-），女，教授，硕士，研究方向为天然产物活性成分研究。