星虫多糖提取工艺优化及其抗氧化作用研究

刘凯丽，贾瑞博，李燕，李鑫，刘斌，黄一帆*

（1.福建农林大学食品科学学院，福州350002；2.国家菌草工程技术研究中心，福州350002；3.福建农林大学动物科学学院，福州350002）

星虫多糖提取工艺优化及其抗氧化作用研究

刘凯丽1，2，贾瑞博1，2，李燕1，2，李鑫2，刘斌1，2，黄一帆3*

（1.福建农林大学食品科学学院，福州350002；2.国家菌草工程技术研究中心，福州350002；3.福建农林大学动物科学学院，福州350002）

以星虫多糖提取率为评价指标，考察不同料液比、超声时间、超声温度、超声功率4个因素对超声辅助提取星虫多糖的影响。在单因素试验的基础上，通过响应面优化试验确定了星虫多糖超声辅助提取的最佳工艺条件为料液比1∶25(g∶mL)，超声温度70℃，超声时间50 min，超声功率400 W。在此工艺条件下进行验证试验，星虫多糖提取率的平均值为7.01%。体外抗氧化研究结果表明，星虫多糖对DPPH自由基、羟自由基清除率分别为76.31%、56.93%，有一定的抗氧化作用。

星虫多糖；超声波；响应面试验；工艺优化；抗氧化

海洋星虫又称沙虫，在我国古代医学著作中多有记载，中医认为其有清肺补虚、滋阴降火的功效，有着“海洋里的冬虫夏草”和“动物人参”的美誉。研究表明，星虫中的主要活性成分为蛋白质、多糖、矿物质元素等，对调节机体多种机能具有重要的作用。随着海洋生物资源的进一步开发和对糖类药物研究的日益重视，海洋动物多糖的研究与开发也将越来越受到关注，成为热点之一。海洋动物多糖具有许多重要的生理活性，如抗肿瘤、抗病毒、降血脂、抗氧化及改善免疫功能[1]。目前国内外对星虫的研究主要集中在养殖技术[2]、营养分析[3]、药用价值[4-5]等方面，对星虫活性物质的生理活性研究表明，星虫多糖具有抗辐射、抗疲劳、抗氧化、抗病毒、调节免疫[6-10]等多种生物学功能。

多糖的提取方法主要有酶法、溶剂浸提法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法等。目前星虫多糖的提取多为热水浸提法、碱提法、酶解法，但存在耗时较长、对温度等条件要求较高且提取率较低等问题[11-12]。而用超声波提取星虫多糖是一种物理过程，不仅能保证试材的生物活性在短时间内保持不变还可提高提取率，缩短提取时间。利用响应面优化法可以对多种试验因素及其相互作用的有效性进行分析，因此，本研究采用超声波辅助提取法对星虫多糖进行提取，考察料液比、超声时间、超声温度、超声功率4个因素对星虫多糖提取率的影响，在单因素试验的基础上，运用响应面法，确定提取星虫多糖的最佳条件，同时对星虫多糖体外抗氧化活性进行研究，期望为海洋多糖的研究和海洋药物的开发提供基础数据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

鲜方格星虫：市售。

葡萄糖，无水乙醇，三氯乙酸，苯酚，浓硫酸，硫化亚铁，过氧化氢，邻羟基苯甲酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美国Sigma公司。

1.2仪器与设备

HH-3A数显三用水浴锅：金坛市精达仪器制造厂；SC-3612低低速离心机：科大创新股份有限公司；EO2140电子分析天平：赛多利斯科学仪器北京有限公司；SHB.IIIS循环水多用真空泵：上海申生科技有限公司；DHG-9240A电热恒温干燥箱：上海一恒科技有限公司；R201旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司；TYPEFDU-1000冷冻干燥机：东京理化器械株式会社；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3试验方法

1.3.1多糖的提取

取匀浆后的方格星虫50 g，经超声辅助提取后，用八层纱布过滤，抽滤后上清液经旋转蒸发仪浓缩至体积的1/3后，加入4倍体积的无水乙醇，4℃过夜。4 500 r/min离心10 min取沉淀，沉淀即为粗多糖，用3%三氯乙酸脱蛋白3次后调pH值为7.0，将多糖溶液流水透析24 h后得到星虫多糖提取液。

1.3.2葡萄糖标准曲线[13]

精确称取烘干至恒质量的葡萄糖0.100 0 g，加入适量蒸馏水溶解，转移至1 000 mL容量瓶中定容备用，得到质量浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。吸取标准葡萄糖溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，置于20 mL试管中，加入蒸馏水至1.0 mL，摇匀。然后向其中加入5%苯酚溶液1.0 mL，再快速垂直加入5.0 mL浓硫酸，摇匀后静置10 min，将试管放在40℃水浴锅中反应15 min，拿出后冷却至室温，用紫外可见分光光度计于波长490 nm处测其吸光度值，以葡萄糖含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，得到回归方程。

1.3.3单因素试验

料液比：分别取方格星虫50 g，超声功率300 W，超声时间为60 min，超声温度为80℃，研究不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL））对星虫多糖提取率的影响。

超声功率：分别取方格星虫50 g，料液比1∶20（g∶mL），超声时间为60 min，超声温度为80℃，研究不同超声功率（200 W、250W、300W、350W、400W）对星虫多糖提取率的影响。

超声时间：分别取方格星虫50 g，超声功率300 W，超声温度为80℃，料液比1∶20（g∶mL），研究不同超声时间（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min）对星虫多糖提取得率的影响。

超声温度：分别取方格星虫50 g，料液比1∶20（g∶mL），超声时间为60 min，研究不同超声温度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）对星虫多糖提取率的影响。

1.3.4响应面试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选取料液比、超声功率、超声温度和超声时间为试验因素，以多糖提取率（Y）为响应值，设计4因素3水平响应面分析试验，对多糖提取工艺进行优化分析，因素及水平见表1。

表1　星虫多糖提取工艺优化响应面试验因素与水平Table1 Factors and levels of response surface experiments for Sipunculus nuduspolysaccharide extraction condition optimization

1.3.5分析方法

多糖的测定：吸取适量提取液，按1.3.2的方法测定样品在波长490 nm处的吸光度值，通过回归方程计算提取液中多糖的含量。星虫多糖提取率计算公式如下：

式中：C为星虫多糖溶液的质量浓度，mg/mL；V为星虫多糖溶液的体积，mL；m为星虫干质量，g。

1.3.6体外抗氧化研究

羟自由基（·OH）清除能力：按照参考文献[14]的方法进行测定，·OH清除率计算公式如下：

DPPH·清除能力：按照参考文献[15]的方法进行测定，DPPH·清除率计算公式如下：

2　结果与分析

2.1标准曲线的测定

以葡萄糖质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，结果见图1。

图1　葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

由图1可知，标准曲线线性回归方程为y=0.981x+0.0033，相关系数R2=0.997 6，标准曲线的拟合度良好，表明吸光度值在葡萄糖质量浓度0～1.2 mg/mL的范围内有良好的线性关系。

2.2单因素试验结果

综上所述，高速公路的大规模施工在我国不断展开，不但使人们的实际需求得到了满足，也使社会各界越来越关注路施工的质量，广大人民群众也渐渐重视软土路基施工的质量，鉴于此，相关施工技术人员应该深入了解路基的真实情况，不断优化、创新软土路基的施工技术，提升软土路基的施工质量。

2.2.1料液比对星虫多糖提取率的影响

由图2可知，随着料液比的增加，星虫多糖提取率逐渐增加，在料液比为1∶20（g∶mL）时星虫多糖提取率达到最高，继续增大料液比，多糖提取率急剧下降。可能的原因是料液比较低时，溶液的黏度过高，使得多糖难以析出，随着料液比的增大，多糖的扩散性增强，多糖提取率有所提高，但料液比过高，溶剂过多，增加了超声波下细胞破壁的阻力，致使星虫多糖提取率下降。因此，选取1∶20（g∶mL）为星虫多糖提取最佳料液比。

图2　料液比对星虫多糖提取率的影响Fig.2 Effect of ratio onSipunculus nuduspolysaccharides yield solid-liquid

2.2.2超声功率对星虫多糖提取率的影响

由图3可知，随着超声功率的增加，星虫多糖的提取率逐渐增加，在超声功率为400 W时星虫多糖提取率达到最高，继续升高超声功率，星虫多糖提取率趋于稳定。可能的原因是随着超声功率的增大，细胞破壁程度增强，较多的多糖可以进入溶剂，致使多糖提取率增加。因此，选取400 W为星虫多糖提取最佳超声功率。

图3　超声功率对星虫多糖提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power onSipunculus nudus polysaccharides yield

2.2.3超声时间对星虫多糖提取率的影响

由图4可知，随着超声时间的增加，星虫多糖提取率逐渐增加，在60 min时星虫多糖提取率达到最高，继续延长超声时间，星虫多糖提取率呈现下降趋势。可能的原因是超声时间过短，多糖的提取不够充分，随着超声时间的增加，破壁的效果增强致使多糖的溶出率增加，但超声时间过长，多糖的次级键被破坏致使多糖降解，从而多糖的提取率降低。因此，选取60 min为星虫多糖提取最佳超声时间。

图4　超声时间对星虫多糖提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time onSipunculus nudus polysaccharides yield

由图5可知，随着超声温度的升高，星虫多糖提取率迅速增加，在60℃时星虫多糖提取率达到最高，继续升高超声温度，星虫多糖提取率基本趋于稳定。可能的原因是随着温度的提高，多糖的溶解度增强，扩散性提高，致使多糖提取率增加，当温度到达一定水平，多糖的溶解度基本不再发生变化，使得多糖提取率基本稳定，但温度过高，部分多糖可能会水解为单糖、低聚糖等，降低了星虫多糖提取率。因此，选取60℃为星虫多糖提取最佳超声温度。

图5　超声温度对星虫多糖提取率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature onSipunculus nudus polysaccharides yield

2.3星虫多糖提取工艺的响应面优化

2.3.1响应面试验设计及结果

在单因素的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选取料液比（A）、超声温度（B）、超声时间（C）和超声功率（D）为4个试验因素，以星虫多糖提取率（Y）作为响应值，设计4因素3水平试验，试验设计及结果见表2。

表2　星虫多糖提取工艺优化响应面试验结果与分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for Sipunculus nuduspolysaccharide extraction condition optimization

采用Design Expert 8.0.6软件对表2结果进行多元模型拟合回归分析，得到星虫多糖提取率（Y）对料液比（A）、超声温度（B）、超声时间（C）和超声功率（D）的二次多项回归模型方程：

对回归模型进行方差分析和系数显著性检验，结果见表3。

表3　回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for quadric regression model of experiment

由表3可知，星虫多糖得率响应面模型的F值为46.5363，P＜0.000 1差异极显著；失拟项的F值为5.271 4，P=0.061 7，差异不显著，说明该模型拟合性较好，数据无异常点，因此由不确定因素所带来的影响可以忽略。模型的决定系数R2= 0.979 0，说明提取率的变化有97.90%来源于所选的4个变量，即料液比、超声温度、超声时间和超声功率；该模型调整决定系数R2Adj=0.957 9；预测样本决定系数R2=0.885 1。由于预测样本的决定系数与调整后的决定系数较一致，故可以得出该模型拟合度良好，回归方程能较好的描述各因素与响应值之间的关系，此模型可用于对星虫多糖提取得率的分析和预测，试验方法有效可靠。

由表3可知，该模型中一次项中B、C、D对该模型的影响达到极显著（P＜0.01）水平，A对该模型的影响达到显著（P＜0.05）水平。二次项中A2和C2和D2对该模型的影响均达到极显著水平（P＜0.01）；此外，该模型的交互项中AD、BC和BD均达到了极显著水平（P＜0.01）。因此可以得出，试验因子对响应值的影响并不是简单的线性关系，且影响星虫多糖提取率因素的顺序为：超声温度（B）＞超声功率（D）＞超声时间（C）＞料液比（A）。

2.3.2交互项作用对星虫多糖提取率影响的分析

通过Design-expert 8.0.6软件，由多项二次回归方程可得到响应面图，见图6。

图6　料液比、超声温度、超声时间、超声功率交互作用对星虫多糖提取率影响的响应面和等高线Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between solid-liquid ratio,ultrasound temperature, time and power onSipunculus nuduspolysaccharide extraction rate

由图6可知，该模型的交互项中AD、BC和BD均达到了极显著水平（P＜0.01）。对二次多项式回归方程进行计算，得到最佳的提取条件为料液比为1∶24.87（g∶mL），超声温度为69.33℃，超声时间为47.88 min，超声功率为386.68 W，预测提取得率为7.029 5%。考虑试验的可操作性，将参数修正为料液比1∶25（g∶mL），超声温度70℃，超声时间50min，超声功率为400 W。进行5次验证试验，得星虫多糖平均提取率为7.01%，与理论预测值基本一致。

2.4星虫多糖体外抗氧化活性测定

图7　星虫多糖及VC对DPPH(a)以及·OH(b)的清除活性Fig.7 Scavenging activity ofSipunculus nuduspolysaccharide and vitamin C on DPPH(a)and·OH(b)

由图7可知，随着样品质量浓度的增加，星虫多糖对DPPH自由基、羟自由基清除率随之增加。在星虫多糖质量浓度为10 mg/mL时，对DPPH自由基、羟自由基清除活性分别达到76.31%、56.93%。均略低于维生素C对DPPH自由基、羟自由基的清除作用。

3　结论

通过单因素和响应面优化试验确定了超声波辅助提取星虫多糖最佳工艺条件：料液比1∶25（g∶mL），超声温度70℃，超声时间50min，超声功率400W，在此工艺条件下星虫多糖平均提取率为7.01%。体外抗氧化研究结果表明，星虫多糖对DPPH自由基、羟自由基清除率分别为76.31%、56.93%，有一定的抗氧化作用。

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Extraction process optimization and antioxidant activity ofSipunculus nuduspolysaccharide

LIU Kaili1,2,JIA Ruibo1,2,LI Yan1,2,LI Xin2,LIU Bin1,2,HUANG Yifan3*
(1.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2.National Engineering Research Center of JUNCAO Technology,Fuzhou 350002,China; 3.College of Animal Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

UsingSipunculus nuduspolysaccharide extraction yield as evaluation index,the effect of solid-liquid ratio,ultrasonic power,temperature and time onS.nuduspolysaccharide extraction yield was studied.Based on single factor experiment results,the optimal extraction technology was determined by Box-Behnken experiment as follows：solid-liquid ratio 1∶25(g∶ml),temperature 70℃,time 50 min,and power 400 W.Under these conditions,verification tests results showed that the average extraction yield ofS.nuduspolysaccharide was 7.01%.In vitroantioxidant activity results showed that the scavenging effect ofS.nuduspolysaccharide on DPPH and·OH was 76.31%and 56.93%,respectively.which showed certain antioxidant activity.

Sipunculus nuduspolysaccharide;ultrasonic;response surface methodology;extraction process optimization;antioxidant

TQ914.1

0254-5071（2016）08-0115-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.026

2016-04-21

国家科技支撑计划子课题（2014BAD15B01）；福建省科技重大专项（2014NZ2002-1）；菌草食药用菌产业化关键技术研究与示范”福建省科技重大专项（2014NZ 2002-1）

刘凯丽（1992-），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。

黄一帆（1954-），男，教授，博士，研究方向为天然药物研究与应用。