兔病毒性出血症病毒分离和鉴定

张颖 王金良

（山东省滨州市畜牧兽医研究院 256600）

兔病毒性出血症病毒分离和鉴定

张颖 王金良

（山东省滨州市畜牧兽医研究院 256600）

从疑似感染兔病毒性出血症病毒的病兔体内分离到1株病毒，病兔表现体温升高、呼吸困难、全身实质脏器出血等典型病变。取病兔肝脏做血凝和血凝抑制试验，分离毒株可以凝集1.0%人 “O”型红细胞，可以被兔病毒性出血症病毒阳性血清中和，对家兔的LD50为10-6.75/ml，是一株对家兔具有高致病力的强毒株，对分离毒株进行RT-PCR检测为阳性，说明该病兔感染了兔病毒性出血症病毒，本病毒的成功分离和鉴定为发病兔场找到了致病原，为兔瘟疾病的诊断和防制提供了参考。

兔病毒性出血症病毒；分离；鉴定

兔病毒性出血症 （Rabbit viral hemorrhagic disease，RHD）是一种急性高度接触性传染病，病原为兔病毒性出血症病毒（Rabbit viral hemorrhagic disease viruses，RHDV），各品种和不同性别的兔均易感，该病主要表现为呼吸系统出血、肝坏死、实质脏器水肿、淤血及出血性变化[1，2]。该病于1984年在我国江苏省江阴县首次暴发[3]，随后广泛流行于世界各地[4.5]，目前该病呈世界范围内流行，每年都给全球养兔业带来严重的经济损失，也是目前危害我国养兔业健康发展的头号杀手[6]。2016年3月，山东省潍坊市某兔场发生了一起以体温升高、食欲下降、鼻孔流血、气管出血、肝脏出血为主要特征的疫病，为对兔场此次疫病进行确诊，获得病原体丰富本单位生物资源及为相应的疫苗研制奠定基础，笔者对该兔场进行了兔病毒性出血症病毒的分离和鉴定，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 临床症状

发病兔表现体温升高、精神沉郁、呼吸困难、呼吸系统出血、肝坏死并出血等典型症状，采集病兔的肝脏作为接种病料样品。

1.2 试剂、血清、红细胞、试验动物

Taq酶、DL 2000 Mrker、胶回收试剂盒购自生工生物工程 （上海）股份有限公司；兔病毒性出血症病毒阳性血清购自中国兽医药品监察所；人“O”型红细胞由滨州市中心血站馈赠；新西兰白兔购自青岛康大兔业发展有限公司。

1.3 病料的处理

采集病兔的肝脏用灭菌生理盐水适当稀释，制成10%乳剂，反复冻融3次，12000r/min离心10min，取上清液经0.22μm滤膜过滤，-20℃保存备用。

1.4 病毒分离

将处理好的病料样品颈部皮下注射体重为2.0kg健康新西兰白兔5只，每日观察试验兔的临床症状，兔死亡后迅速剖检并观察病理变化，无菌采集死亡兔的病变组织样品按上述方法再传2代。

1.5 血凝试验

采用微量法测定分离毒株对1.0%人 “O型”红细胞的凝集性。

1.6 中和试验

将分离毒株与等量抗兔病毒性出血症病毒阳性血清混匀，37℃中和反应1h后做血凝试验。

1.7 毒力试验

用灭菌生理盐水将分离株病毒依次作10倍系列稀释，取每个稀释度分别颈部皮下注射健康新西兰白兔5只，1.0ml/只，计算分离毒株对家兔的LD50。

1.8 RT-PCR鉴定

根据参考文献[7]设计兔病毒性出血症病毒特异性检测引物 （P1:5'-CGTGC TTCAGTTTTGGTA-3'；P2:5'-ATGAGTGCTGACGAGTAG-3'），引 物由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成。按照参考文献[7]中兔病毒性出血症病毒RT-PCR反应条件进行分离毒株的PCR检测，对PCR扩增产物送生工生物工程 （上海）股份有限公司测序鉴定。

2 结果与分析

2.1 病毒分离结果

组织病料样品连续传代3次均对家兔具有高致病性，攻毒家兔均100%死亡，死亡兔表现出鼻孔出血、尸体僵直等临床症状，剖检观察可见气管出血，呈现 “红气管”特征，肝脏、脾脏、肾脏、心脏等实质脏器出血、瘀血、肿大。无菌收集第3代分离株病毒，命名为WF株，-20℃保存备用。

2.2 血凝性的测定结果

微量法测定WF株病毒对人 “O”型红细胞的凝集效价为1：1024。

2.3 中和试验结果

WF株病毒与等量抗兔病毒性出血症病毒阳性血清37℃中和反应1h后对人 “O”型红细胞无凝集效价，WF株病毒的血凝作用被抑制，证实分离毒株为兔病毒性出血症病毒。

2.4 毒力试验结果

按Reed-Muench法测定WF株病毒对家兔的LD50为10-6.75/ml，分离毒株具有较强的毒力。

2.5 PCR鉴定结果

按照参照文献[7]的方法，WF株病毒可扩增出586bp目的条带 （见附图），与预期大小相一致。PCR扩增产物送生工生物工程 （上海）股份有限公司测序鉴定为兔病毒性出血症病毒VP60基因特异性序列，从分子水平鉴定为该病兔发生了兔病毒性出血症病毒感染。

3 讨论

本研究从疑似感染兔病毒性出血症病毒的病兔体内分离到1株兔病毒性出血症病毒。该病毒与1.0%人 “O”型红细胞做微量血凝试验阳性，利用兔病毒性出血症病毒标准阳性血清可以中和分离的兔病毒性出血症病毒。病毒分离是疾病诊断的可靠方法，为了对病毒分离结果进行验证，本研究还进行了分子生物学PCR检测，通过对PCR扩增产物测序鉴定说明，分离毒为兔病毒性出血症病毒的特异序列，为病兔发生兔病毒性出血症病毒感染提供有力的诊断依据。通过对兔病毒性出血症病毒的分离鉴定，为兔病毒性出血症病毒相关疾病的诊断提供参考，也为本实验室研制安全、高效的RHD疫苗奠定了基础。

附图 PCR扩增结果

兔场发生兔病毒性出血症病毒感染后，对发病兔采取紧急隔离饲养，饲养场进行严格消毒，粪、垫草和污物集中销毁，兔群进行兔病毒性出血症疫苗的紧急免疫接种，对器具、水槽和饲料槽用消毒药浸泡、清洗和消毒。本病的发生与饲养场卫生环境不良有很大关系，饲养密度过大，通风不良，兔舍阴暗潮湿，兔病毒性出血症疫苗免疫接种不及时等有很大关系，通过对本病的诊治，提高了养殖场对本病的重视，改善了兔场的饲养环境，兔病毒性出血症的发病情况得到有效控制。

[1]谭永贵,缪秋红,吴巧梅,等.新型兔出血症病毒研究进展[J].中国动物传染病学报,2016,24(1):80-86.

[2]汪亮.兔病毒性出血症的流行、诊断及防控[J].畜牧兽医科技信息,2015(10):12-13.

[3] 刘胜江,薛华平,蒲伯清,等.兔的一种新病毒病-兔病毒性出血症[J].畜牧与兽医,1984（6):253-255.

[4]Mitro S,Krauss H.Rabbit hemorrhagic disease:a review withspecialreference to its epizootiology[J].Eur J Epldemio,1993,9(1):70-78.

[5]Nowotny N,Ros Bascunana C,Ballagi-Pordany A,et al.Phylo-geneifc analysis of rabbithaemorrhagic disease and European brownhare Syndrome viruses by comparison of sequences fromthe capsidprotein gene[J].Arch Virol,1997,142(4):657-673.

[6]曹德祥,白玫.兔病毒性出血症的流行症状以及防控措施[J].山东畜牧兽医,2015(1):49.

[7]程汉,曹军平,包祥嘉.兔出血症病毒RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J].江苏农业科学,2013,41(4):191-193.

张颖 （1975.6-)，女，助理研究员，研究方向：生物制剂。