家兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗菌种筛选

马增晖 （河北省迁安市农业畜牧水产局 064400)

家兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗菌种筛选

马增晖 （河北省迁安市农业畜牧水产局 064400)

兔波氏杆菌病是一种严重危害养兔业的细菌性疾病。兔波氏杆菌病可引起家兔的传染性鼻炎，特别是在规模化养兔场，波氏杆菌与巴氏杆菌、葡萄球菌混合感染相当普遍，已成为兔病防治的一大难题。接种疫苗是目前预防这两种疾病的最有效的措施。本研究从Bb分离株中筛选得到制苗用兔波氏杆菌1株，为研制Bb灭活疫苗打下了坚实的基础。现将菌种的筛选及生物学特性的试验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用菌株

Bb分离株6株；沙门氏菌、魏氏梭菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌，均购自中国兽药监察所。

1.1.2 试验动物

16～18g的清洁级小鼠；30日龄左右的健康家兔。

1.1.3 常规培养基

血清血红素平板、TSA平板、胆硫乳 （DHL）平板、麦康凯平板、马丁肉汤等 (按常规方法配制)。

1.1.4 生化培养基及试剂

蛋白胨水、硝酸盐还原培养基、葡萄糖磷酸盐胨水、枸椽酸盐培养基、糖类发酵管、尿素培养基、三糖铁培养基均购自杭州天和微生物试剂有限公司。3%H2O2按照常规方法配制。

1.1.5 血清

Bb标准阳性血清和阴性血清。

1.2 方法

1.2.1 对小鼠的毒力测定

将6株Bb纯培养物接种马丁肉汤，置37℃摇动 （120r/min）培养24h。选择16～18g小鼠分为6组，每组4只。以0.2ml/只腹腔注射，观察3～5d，记录小鼠死亡时间，死亡者剖检，以分离到接种菌为标准。

1.2.2 最小致死剂量 (MLD)的测定

（1）对小鼠最小致死剂量测定。将3株Bb强毒株纯培养物接种马丁肉汤，置37℃摇动 （120r/min）培养24h。用平板培养法进行菌落计数，据结果将菌体浓度调整为1×109CFU/ml。将小鼠随机分3批，每批3组，每组2只，分别腹腔注射上述活菌1ml，0.1ml，0.01ml，另取6只小鼠分3批作对照，每批注射等量灭菌生理盐水。观察3～5d。详细记录小鼠死亡时间，并对死亡小鼠无菌取心血、肺，划麦康凯平板于37℃温箱培养。

（2）对家兔的最小致死剂量测定。将3株Bb强毒株纯培养物分别用接种环挑取菌落划满血清血红素平板，置37℃培养24h，用马丁肉汤洗下，计数，把菌液浓度调整为2×1010CFU/ml。将家兔随机分3批，每批4组，每组4只，分别静脉注射上述活菌2ml，1ml，0.5ml，0.25ml，另取6只家兔分3批作对照，每批注射等量灭菌生理盐水。接种后，各组隔离饲养，观察7d。详细记录家兔死亡时间，并对死亡家兔无菌取心血、肺划麦康凯平板，置37℃温箱培养观察。

1.2.3 血清学交互试验

（1）细菌的培养与计数。将3株Bb强毒株分别接种到血清血红素平板上，在37℃恒温箱中培养24h，纯检，用接种环挑取菌落划满血清血红素平板，37℃培养24h，纯检，用马丁肉汤洗下，计数，把菌液浓度调整为2.5×1010CFU/ml，加入0.2%的甲醛溶液灭活24h，灭活检验合格后分为两份备用。

（2）免疫原制备。取检验合格的菌悬液1份，加20%的灭活铝胶佐剂，调整菌液最终浓度为2×1010CFU/ml，4℃冰箱中保存，作为免疫原使用。

（3）微量凝集抗原制备。取另1份菌悬液，先用生理盐水洗涤3次。每次用生理盐水混匀，10000r/min离心20min，直至上清液清澈为止，弃去上清液。取沉淀用生理盐水稀释至1.2×1010CFU/ml，在悬浊液内添加甲醛，使其最终浓度为0.3%。在4℃环境下慢慢振荡，灭活4h。按1/10000比例添加硫柳汞后，在4℃冰箱中冷藏保存，作为微量凝集抗原原液使用。使用时，用生理盐水稀释至3×109CFU/ml。

（4）兔Bb高免血清的制备：经血清平板凝集试验检查为Bb抗体阴性的健康家兔6只，分别用上述抗原免疫，每株细菌免疫2只家兔，共免疫3次，每次间隔1周，免疫菌体的量依次为0.5ml、1ml、1ml。末次免疫后7d试血，待兔血清微量凝集价高于1:256时心脏采血、分离血清。分别用接种环挑取沙门氏菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、葡萄球菌、魏氏梭菌平板培养物各1环，与血清进行平板凝集试验，检测特异性，合格者分装置-20℃保存。

（5）微量凝集试验：Bb强毒菌株抗原分别与上述高免血清进行微量凝集试验，选取交叉反应性最好的菌株作为制苗用菌株。试验设阳性血清和阴性血清对照。

1.2.4 3株Bb强毒株对小鼠交互免疫保护试验

（1）交互免疫保护试验免疫原的制备。参照1.2.3中免疫原的制备。

（2）交互免疫保护试验方法。试验组小鼠腹腔注射上述免疫原0.3ml，对照组小鼠腹腔注射等量灭菌生理盐水。15d后以24h内致死小鼠剂量攻毒，记录结果，选取保护率最高的Bb疫苗菌株作为制苗用菌株。

1.2.5 对制苗用兔支气管败血波氏杆菌菌株进行生物学特性鉴定。

2 结果与分析

2.1 对小鼠的毒力测定

将分离菌马丁肉汤培养物腹腔注射小鼠后，3d内小鼠几乎全部死亡。据具体死亡时间 （见表1），从6株Bb中筛选出3株最强菌株，菌种编号分别为 AH0702，HN0701，SD0612。从死亡小鼠心脏、肺脏均能分离到与接种菌一致的病原菌。

2.2 最小致死剂量 (MLD)的测定

3株Bb强毒株对小鼠及家兔的最小致死剂量 (见表2)。3株Bb强毒株对小鼠的最小致死剂量都是0.01ml(菌液浓度1×109CFU/ml)，对家兔的最小致死剂量分别为0.25ml，0.5ml，0.25ml(菌液浓度2×1010CFU/ml)。 其中SD0612和AH0702株MLD最低，再通过对SD0612和AH0702株MLD致死小鼠、家兔死亡时间上进行比较，SD0612株Bb毒力最强 （见表3、4）。从死亡小鼠、家兔心脏、肺脏均能分离到接种菌。

2.3 血清学交互试验

试验中制备的上述3株Bb的高免血清与对照菌株均无凝集反应，因此，这3株血清均具有种属特异性。用这些血清对Bb的3株强毒株进行血清学交叉反应时，如表5所示，3个菌株都可发生交互凝集。SD0612株的交叉反应性最好，其高免血清与3个毒株发生的凝集反应凝集效价都非常高；AH0702、HN0701株次之。

2.4 3株Bb强毒株对小鼠交互免疫保护试验

在用这3个菌株进行小鼠的交互免疫保护试验时，SD0612株抗原对3株Bb强毒攻击的总保护率最高 (见表6)，与血清学交互试验完全符合，故将其作为制苗用菌株。

2.5 兔支气管败血波氏杆菌SD0612株的生物学特性

2.5.1 形态及生化特性

本菌为革兰氏阴性，球杆菌，两端钝圆，散在，少数成双存在，两极染色不明显。生化试验结果为不发酵葡萄糖等碳水化合物，不产生靛基质、硫化氢；M-R试验为阴性；V-P试验阳性；分解尿素；不能利用枸椽酸钠，还原硝酸盐。

2.5.2 血清型

与SD0612株的高免血清进行玻片凝集试验，结果均呈阳性反应；在血平板上生长呈β溶血且致死小鼠，说明SD0612株是I相菌。

表1 分离菌对小鼠的毒力试验结果

表2 3株Bb对小鼠、家兔的MLD测定结果

表3 对小鼠的最小致死剂量 (MLD)测定结果

表4 对家兔的最小致死剂量 (MLD)测定结果

表5 血清学交叉反应结果

2.5.3 菌落型

将菌种接种于TSA平板上培养24h，菌落呈淡黄色、直径0.5～1mm、表面隆起、湿润、光滑、透明、有光泽。在胆硫乳 （DHL）平板上则形成直径为2mm左右，无色，表面湿润、光滑，边缘整齐的菌落；在麦康凯培养基上培养30h，菌落呈茶黄色、直径1～2mm，表面隆起、湿润、光滑、透明、有光泽，培养基颜色由红色变为黄色。鲜血平板上24h形成1mm左右乳白色菌落，菌落周围有β溶血圈，菌落湿润，中心隆起，边缘整齐。

表6 3株Bb强毒株交互免疫保护试验

2.5.4 菌株毒力

SD0612株0.01ml(菌液浓度1×109CFU/ml)活菌腹腔注射16～18g的小鼠，小鼠于3d内死亡。

2.5.5 免疫原性

用16～18g小鼠10只，腹腔注射以20%铝胶生理盐水稀释的SD0612株灭活菌液0.3ml(含活菌60亿)，15d后，连同条件相同的对照鼠10只，腹腔注射SD0612株3MLD，观察7d。结果，注射3MLD的对照小鼠全部死亡，免疫鼠有8只获得保护。

3 讨论与小结

Ⅰ相菌有不耐热的荚膜和短鞭毛，具有强坏死毒素，对小鼠和家兔有高度的致病性。而Ⅱ相菌和Ⅲ相菌则无致病性。据此，通过对小鼠的毒力测定，对小鼠，家兔的最小致死剂量的测定，血清学交互反应和小鼠交互免疫保护试验，并对SD0612株进行生物学特性的鉴定，结果表明，该菌株毒力较强，免疫原性好。故选择SD0612株作为制苗用菌种。