猪源马链球菌兽疫亚种的分离与鉴定

付强 许华明 陈秋玉 林志娴 李锋莹 （佛山科学技术学院 528231）

猪源马链球菌兽疫亚种的分离与鉴定

付强 许华明 陈秋玉 林志娴 李锋莹 （佛山科学技术学院 528231）

从广东省佛山市某养殖场患呼吸道疾病的生猪体内分离到一株致病菌 （SSgd0511），通过细菌微量生化鉴定管、革兰氏染色法镜检及16S rDNA基因序列分析鉴定该菌。结果表明，该菌为革兰氏阳性球菌，能利用乳糖、七叶苷、棉子糖、菊糖阳性；16S rDNA基因序列与BLAST比对，结果与马链球菌兽疫亚种的同源性最高，表明本试验分离得到一株马链球菌兽疫亚种。

猪；马链球菌兽疫亚种；鉴定

猪链球菌病是危害养猪业的重要细菌性疾病，严重危害我国乃至世界养猪业的发展。我国猪链球菌的主要病原。我国猪链球菌病的病原主要包括猪链球菌2型 （Streptococcus suis serotype 2，SS2）和马链球菌兽疫亚种 (Streptococcus equi ssp.Zooepidemicus， S.zooepidemicus)。S.zooepidemicus 属于乳杆菌目、链球菌科、链球菌属，能引起猪、马、牛等多种动物发病，试验动物小鼠、犬等对该菌也极为易感，在我国该菌主要引起猪链球菌病[1-3]。现阶段全面控制S.zooepidemicus感染仍然存在很多困难[4-5]，主要原因是对S.zooepidemicus的毒力因子和保护抗原的研究仍不够深入。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

病猪来自广东省佛山市某养殖场，病猪主要表现为高热，身体末梢皮肤红紫，呼吸困难，粪便干硬，精神沉郁，跛行。

1.1.2 试剂

细菌微量生化鉴定管，购自广东环凯生物有限公司；T4连接酶、DNA Marker、细菌DNA提取试剂盒和PCR相关试剂，购自宝生物工程 （大连）有限公司；UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒、革兰氏染色液，购自广州瑞真生物有限公司；细菌16S rRNA基因引物由上海生工生物工程技术服务有限公司；胰蛋白胨、LB培养基、TSA培养基购于广州迪景生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离纯化

无菌条件下从病猪的肺脏、关节液取样，接种与营养琼脂培养基，37℃培养48h。挑选优势菌落进行纯化培养，并接种于斜面培养基，37℃培养24h后置于4℃冰箱保存备用。

1.2.2 细菌的生化鉴定

用琼脂平板培养基培养并纯化细菌，观察其形态特征、菌落大小。并对纯化的细菌进行革兰氏染色，显微镜下观察。根据细菌微量生化鉴定管的说明书检测该菌的生理生化指标。

1.2.3 16S rDNA序列分析

按试剂盒说明书提取SSgd0511的基因组序列，作为PCR扩增的模板，选用细菌16S rDNA通用引物P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、P2： 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增。PCR反应体系如表一所示。PCR扩增程序：95℃预变性 5min，95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；共35个循环，72℃再延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收的PCR产物与pMD19-T Simple Vector载体进行连接并转化至DH5ɑ感受态细胞，送上海英潍捷基生物技术有限公司测序。运用NCBI的BLAST程序将得到的16S rDNA序列进行同源性比对，选取相似性较高的序列，采用MEGA5软件构建系统发育树。

2 结果

2.1 分离菌的特征

分离得到的菌株编号为：SSgd0511，接种单菌落到固体培养基，菌落直径约1～3mm，灰白半透明，呈卵圆形；接种到液体培养基，菌体表面能形成荚膜；在绵阳血琼脂平板呈β溶血。

2.2 分离菌的革兰氏染色结果

分离菌通过革兰氏染色，在显微镜下看到的是呈蓝紫色的球形或卵圆形，排列成长短不等的链状，表明本试验的分离菌株SSgd0511属于革兰氏阳性球菌。

2.3 分离菌的生理生化特性

通过细菌微量生化鉴定管检测分离菌株SSgd0511的生理生化指标，结果乳糖、七叶苷、棉子糖、菊糖呈阳性；VP、6.5%高盐肉汤、pH9.6肉汤、甘露糖、山梨糖、阿拉伯糖、甘露醇、松三糖、D核糖、甘油、马尿酸盐呈阴性。

附表 PCR反应体系

图1 分离菌的革兰氏染色结果

2.4 分离菌16S rDNA序列分析及发育树

将测序得到的SSgd0511的16S rDNA序列与美国国家生物技术信息中心的序列进行BLAST分析，显示与马链球菌兽疫亚种的同源性为99%，从而确定此分离菌株SSgd0511为马链球菌兽疫亚种，系统发育树显示，SSgd0511的16S rDNA序列与马链球菌聚为一枝。

图2 基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树

3 讨论

猪链球菌病是当今危害养猪业的一种重要的细菌性疾病，严重危害着我国乃至世界养猪业的发展。外国研究人员Terri等通过对不同猪场进行抽样检查，发现最容易从扁桃体中分离鉴定到的细菌是猪链球菌[6]。研究人员Tang等对我国16省市2912例猪呼吸道疾病临床样本进行细菌分离鉴定[7]，猪链球菌的分离率最高，达到24.2%。我国研究人员Zhao等的研究同样表明，猪链球菌病在我国处于猪细菌性疾病的首位[8]。我国猪链球菌病的病原主要包括猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种。马链球菌兽疫亚种主要引起马、猪、牛、狗、猫等多种动物下呼吸道感染，并引起败血症、脑膜炎、关节炎，肺炎以及突发性死亡等症状。S.zooepidemicus引起的猪链球菌病曾在我国华南、西南和华东等地区广泛流行。1975年在四川省大面积爆发猪链球菌病，导致近百万猪发病、30多万猪的死亡。2007年广西51个县市又出现该病的大流行，经济损失惨重。直至现在，我国的养猪产业仍受到猪链球菌病的影响。

S.zooepidemicus属于乳杆菌目、链球菌科、链球菌属，为革兰氏阳性菌。在固体培养基中，该菌菌落直径约1～4mm，灰白半透明，呈卵圆形，以短链的形式存在；在液体培养基中则可形成长链，菌体表面能形成荚膜；在绵阳血琼脂平板呈β溶血，与本试验分离菌株SSgd0511的特征基本一致。本试验的病猪来自广东省佛山市某养殖场，病猪主要表现为高热，身体末梢皮肤红紫，呼吸困难，粪便干硬，精神沉郁，跛行，这些症状与S.zooepidemicus引起的猪链球菌病的症状基本一致。细菌微量生化鉴定结果乳糖、七叶苷、棉子糖、菊糖呈阳性；VP、6.5%高盐肉汤、pH9.6肉汤、甘露糖、山梨糖、阿拉伯糖、甘露醇、松三糖、D核糖、甘油、马尿酸盐呈阴性，与猪链球菌的特征相似。进一步将分离株SSgd0511的16S rDNA序列与美国国家生物技术信息中心的序列进行BLAST分析，显示与马链球菌兽疫亚种的同源性为99%，系统发育树结果显示SSgd0511的16S rDNA序列与马链球菌聚为一枝，从而确定此分离菌株SSgd0511为马链球菌兽疫亚种。

[1]Gruszynski K,Young A,Levine S J,et al.Streptococcus equi subsp.zooepidemicus infections associated with guinea pigs[J].Emerg Infect Dis,2015,21(1)：156-158.

[2]Velineni S,DeNegri R,Artiushin S C,et al.Comparison of specificities of serum antibody responses of horses to clinical infections caused by Streptococcus equi or zooepidemicus[J].Vet Microbiol,2015,180(3-4)：253-259.

[3]Watson J R,Leber A,Velineni S,et al.Recurrent Streptococcus equi subsp.zooepidemicus Bacteremia in an Infant[J].J Clin Microbiol,2015,53(9)：3096-3099.

[4]Yi L,Wang Y,Ma Z,et al.Identification and characterization of a Streptococcus equi ssp.zooepidemicus immunogenic GroEL protein involved in biofilm formation[J].Vet Res.,2016,47(1)：1-9.

[5]Tang F,Li D,Wang H,et al.Prophage lysin Ply30 protects mice from Streptococcus suis and Streptococcus equi subsp.zooepidemicus infections[J].Appl Environ Microbiol,2015,81(21)：7377-7384.

[6]O，Sullivan T,Friendship R,Blackwell T,et al.Microbiological identification and analysis of swine tonsils collected from carcasses at slaughter[J].Canadian Journal of Veterinary Research,2011,75(2)：106-111.

[7]Tang X,Zhao Z,Hu J,et al.Isolation,antimicrobial resistance,and virulence genes of Pasteurella multocida strains from swine in China[J].J Clin Microbiol 2009,47(4)：951-958.

[8]Zhao Z,Wang C,Xue Y,et al.The occurrence of Bordetella bronchiseptica in pigs with clinical respiratory disease[J].Vet J,2011,188(3)：337-340.

广东省自然科学基金项目 （2014A030310020）；广东高校优秀青年创新人才培养计划项目 （2014KQNCX179）。

付强 （1983-），男，博士，讲师，主要从事动物分子免疫学研究。