牛磺酸对裸鼠乳腺癌模型肿瘤生长的影响及其机制

宋玉美贺瑜梁柏莹郭松超欧阳轶强

作者单位：530021南宁广西医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室

牛磺酸对裸鼠乳腺癌模型肿瘤生长的影响及其机制

宋玉美贺瑜梁柏莹郭松超欧阳轶强

作者单位：530021南宁广西医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室

目的探讨牛磺酸对裸鼠乳腺癌模型肿瘤生长的影响及机制。方法10只SPF级5周龄裸鼠接种MDA-MB-231乳腺癌细胞后随机分为牛磺酸干预组和对照组，每组5只。牛磺酸干预组给予添加5%的牛磺酸饮水，对照组给予正常无菌饮水。测量两组小鼠肿瘤体积和肿瘤质量，采用蛋白免疫印迹法检测雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、人类表皮生长因子受体2（human epidemic growth factor receptor 2，HER-2）和鸟苷三磷酸酶激活蛋白（guanosine triphosphatase activating protein，p21ras）表达量的变化。结果实验结束时所有裸鼠均存活，裸鼠乳腺癌模型造模成功。牛磺酸对裸鼠乳腺癌模型肿瘤的抑制率为41.6%。相对于对照组，牛磺酸干预组裸鼠肿瘤组织中ER表达量提高了134%（P＜0.05），PR表达量提高了47.5%（P＜0.05），HER-2表达量降低了67%（P＜0.05），p21ras表达量降低了62.2%（P＜0.01）。结论牛磺酸可抑制裸鼠乳腺癌模型肿瘤生长，其机制可能与上调ER、PR和下调HER-2、p21ras有关。

乳腺肿瘤；牛磺酸；抗肿瘤；裸鼠；雌激素受体；孕激素受体；人类表皮生长因子受体2；鸟苷三磷酸酶激活蛋白

牛磺酸是一种人体条件必需的含硫氨基酸，是机体内源性抗损伤物质。研究发现牛磺酸可通过增强大鼠机体的免疫力、抗氧化能力、DNA损伤修复和抑制癌细胞增殖等途径，抑制大鼠肿瘤的生长［1］，对二甲基苯蒽诱导的大鼠乳腺癌有一定治疗作用［2］。MDAMB-231细胞引起的乳腺癌侵袭性强、转移率高、预后较差，且缺乏有效的治疗方法［3］。本实验采用人类乳腺癌细胞MDA-MB-231接种裸鼠，建立裸鼠乳腺癌模型，观察牛磺酸对裸鼠乳腺癌模型肿瘤生长的影响，并探讨其干预机制，以期为乳腺癌的治疗提供实验基础。

1　材料与方法

1.1实验动物与细胞

5周龄SPF雌性BALB/c裸鼠10只，体重18～22 g，取自广西医科大学实验动物中心（生产许可证号：SCXK桂2014-0002）。乳腺癌MDA-MB-231细胞为广西医科大学保存提供。

1.2主要试剂和仪器

L-15培养基（美国Gibco公司）、胎牛血清（上海依科赛生物制品公司）、青霉素链霉素双抗、0.25%胰蛋白酶。一抗：ER鼠单克隆抗体、PR鼠单克隆抗体、HER-2鼠单克隆抗体、p21ras鼠单克隆抗体均为美国Origene公司产品。二抗：HRP标记的山羊抗鼠多克隆抗体为英国Abcam公司产品。RIPA裂解液和PMSF购自碧云天生物科技公司。PVDF膜，TBST洗脱液，脱脂奶粉，ECL发光试剂盒，BCA蛋白定量试剂盒，牛磺酸粉剂（楚牛牌食品添加剂，GB14759-2010），1%戊巴比妥钠，全波长酶标仪，超声波组织破碎仪，Western Blot凝胶电泳仪，化学发光成像分析系统购自美国Protein Simple公司。

1.3裸鼠乳腺癌模型的建立

人乳腺癌MDA-MB-231细胞用含10%胎牛血清、1%青霉素链霉素双抗的L-15培养基在37℃二氧化碳细胞培养箱中培养，细胞计数后用生理盐水调整细胞数目至1×107个/mL，在裸鼠左侧的第二对乳腺脂肪垫下注射0.1 mL生理盐水定量的细胞后，将10只裸鼠随机分为牛磺酸干预组和对照组，每组5只。牛磺酸干预组裸鼠给予5%的牛磺酸饮水，对照裸鼠给予正常无菌饮水，两组裸鼠饮水量及进食量一致，每只裸鼠饮水量约为6 mL/d。每两天观察、测量并记录细胞接种部位肿瘤的生长情况。第40天用1%戊巴比妥钠过量麻醉处死荷瘤裸鼠，完整剥离肿瘤，测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积（肿瘤体积=长径×短径2/2），绘制肿瘤生长曲线。同时称量肿瘤质量，计算肿瘤抑制率=（对照组肿瘤平均质量-牛磺酸干预组肿瘤平均质量）/对照组肿瘤平均质量×100%。肿瘤组织放于液氮速冻，转而保存于-80℃冰箱。

1.4蛋白免疫印迹法检测ER、PR、HER-2、p21ras蛋白的表达情况

取30 mg肿瘤组织加入400 μL裂解液匀浆，超声裂解组织，11 000 r/min离心5 min，取上清液，用BCA定量法测蛋白浓度。将上清液与2X上样缓冲液混合后，100℃加热5 min变性。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉封闭，分别加一抗ER、PR、HER-2、p21ras单克隆抗体（抗体浓度为1∶2 000），4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，加HRP标记过二抗（抗体稀释浓度为1∶4 000），室温孵育2 h，TBST漂洗3次，多功能成像系统曝光。以GAPDH做内参，用Alpha View软件分析条带的灰度值，计算两组肿瘤蛋白表达量含量。

1.5组织病理学检查

裸鼠乳腺癌肿瘤组织浸入福尔马林溶液（10%甲醛）固定后，对肿瘤组织进行取材、脱水、包埋、切片，经HE染色后，在显微镜下观察，进行病理学鉴定。

1.6统计学处理

采用SPSS 16.0软件对数据进行统计学分析，实验结果用均数±标准差（±s）表示，独立样本比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1裸鼠造模情况

实验期间所有裸鼠均存活，实验结束时，所有裸鼠均长出肿瘤，肿瘤最大体积的长径和短径均约2 cm，符合实验预期，表明造模成功。见图1。

2.2裸鼠肿瘤组织病理学检查结果

肉眼观察：两组肿瘤组织均为浅灰白色，似有包膜，质地略软，切开似有坏死。镜下观察：乳腺结构不明显；肿瘤呈实体性，细胞丰富，无腺管状结构；肿瘤细胞增生活跃，多为合体细胞，细胞排列不规则，细胞核呈空泡状，可见核分裂相；癌巢内有坏死和出血，癌巢周围可见淋巴细胞、浆细胞浸润等病理改变，两组组织病理学表现相似，均诊断为裸鼠乳腺髓样癌。病理切片结果符合乳腺癌组织病理特征，裸鼠乳腺癌模型造模可靠。见图2。

图1　实验结束时裸鼠肿瘤生长情况

图2　两组裸鼠肿瘤组织的病理学检查结果

2.3牛磺酸对裸鼠乳腺癌模型肿瘤生长的影响

接种肿瘤细胞25 d后，牛磺酸干预组肿瘤体积较对照组明显减缓（见图3）。实验结束时，牛磺酸干预组裸鼠的肿瘤体积为（178.70±67.02）cm3，肿瘤质量为（2.02±0.75）g；对照组肿瘤体积为（306.01±45.93）cm3，肿瘤质量为（3.46±0.95）g，两组肿瘤体积和质量比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。实验结束时牛磺酸对裸鼠乳腺癌肿瘤的抑制率为41.6%。提示牛磺酸能有效抑制肿瘤生长。

2.4牛磺酸对裸鼠肿瘤组织中ER、PR、HER-2和p21ras蛋白表达的影响

蛋白免疫印迹实验表明，与对照组比较，牛磺酸干预组肿瘤组织中ER表达量提高了134%（P＜0.05），PR表达量提高了47.5%（P＜0.05）；HER-2表达量下降了67%（P＜0.05），p21ras表达量下降了62.2%（P＜0.01），差异均有统计学意义。见图4。

图3　两组裸鼠乳腺癌模型的肿瘤体积生长曲线比较

图4　两组裸鼠肿瘤组织中ER、PR、HER-2和p21ras蛋白免疫印迹比较

3　讨论

本实验采用裸鼠注射MDA-MB-231乳腺癌细胞，建立裸鼠乳腺癌模型。经病理切片检查结果证实裸鼠肿瘤组织为乳腺髓样癌，说明建立的裸鼠乳腺癌模型可靠。牛磺酸干预组裸鼠给予牛磺酸饮水25 d后，肿瘤体积和质量明显下降，实验结束时两组肿瘤体积和质量比较差异有统计学意义，牛磺酸对裸鼠乳腺癌肿瘤的抑制率为41.6%，提示牛磺酸具有抑制乳腺癌肿瘤组织生长的作用。

乳腺癌内分泌治疗是降低复发率和死亡危险的有效手段，ER和PR是临床上乳腺癌内分泌治疗中的靶分子，在乳腺癌进展和治疗过程中有重要作用［4］。ER和PR也是判断乳腺癌预后的有效指标，有报道ER和PR阳性表达者，其治愈率较高，而复发率较低［5，6］。Ruddy等［7］研究亦发现ER和PR阳性表达者对内分泌治疗较敏感，可使肿块缩小，癌细胞凋亡，其术后5年生存率高于阴性者［8］。本研究中，蛋白免疫印迹检测发现，接种MDA-MB-231乳腺癌细胞的裸鼠模型经牛磺酸干预，相比对照组，ER和PR的表达量明显提高，说明牛磺酸可能通过提高肿瘤组织中ER和PR的表达而干预乳腺癌内分泌环节的调控，从而影响乳腺癌肿瘤的发展。

HER-2参与了多种肿瘤的发生、发展，是肿瘤治疗的研究热点之一，也是乳腺癌治疗的靶分子之一。国内外学者报道，HER-2与癌细胞转移和复发有关，HER-2高表达的乳腺癌患者其预后较差［9，10］。HER-2过表达亦可导致肿瘤发生、转移及产生药物抵抗，对激素疗法和化疗药物产生耐受［11］。本实验中牛磺酸干预组组织中HER-2的表达量明显降低，说明牛磺酸对HER-2的表达有一定抑制作用，牛磺酸可能通过降低HER-2的表达，参与乳腺癌细胞的生长增殖环节，抑制肿瘤细胞分裂增殖，促进细胞凋亡，减缓肿瘤增长速度，从而发挥控制肿瘤生长的作用。

p21ras是调控细胞生长分化的信号因子，是RAS基因的表达产物。RAS基因是人类最常见的原癌基因，许多肿瘤中都发现RAS基因过度活跃，因此也成为治疗肿瘤的靶点［12］。p21ras与下游相关效应蛋白组成信号传导通路，调控细胞的生长、分化和凋亡，当p21ras过表达，信号传导通路激活，导致细胞恶性转化，从而产生癌变。在已有的报道中，多项实验研究证明，在多种肿瘤细胞中均发现p21ras过量表达的现象。本实验结果亦显示，牛磺酸干预组组织中p21ras表达量降低，提示牛磺酸可能通过降低p21ras表达量，参与和控制肿瘤细胞的生长分化进程，从而延缓肿瘤生长。

综上所述，牛磺酸对裸鼠乳腺癌模型肿瘤表现出较好的抑制作用，其机制可能是牛磺酸通过对乳腺癌发生发展相关的ER、PR、HER-2和p21ras蛋白进行良性调控，从肿瘤的内分泌以及细胞生长、增殖和分化等环节，抑制乳腺癌细胞生长，减缓了裸鼠乳腺癌模型肿瘤生长。

［1］薛美兰，张华荣，姜长青，等.牛磺酸抑制二甲基苯蒽诱发大鼠乳腺癌及其机制研究［J］.营养学报，2008，30（1）：57-60.

［2］Vanitha MK，Baskaran K，Periyasamy K.et al.Modulatory effect of taurine on 7，12-dimethylbenz（a）Anthracene-induced alterations in detoxification enzyme system，membrane bound enzymes，glycoprotein profile and proliferative cell nuclear antigen in rat breast tissue［J］.J BiochemMol Toxicol，2016，30（8）：414-423.

［3］Wu K，Yang Q，Liu Y，et al.Meta-analysis on the association between pathologic complete response and triple-negative breast cancer after neoadjuvant chemotherapy［J］.World J Surg Oncol，2014，12（6）：95.

［4］Early Breast Cancer Trialists'Collaborative Group（EBCTCG）.Efects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival：an overview of the randomized trials［J］.Lancet，2005，365（9472）：1687-1717．

［5］Differ A，Burhanedtin-Zincircioglu S，Karadayi B，et al.Characteristics and prognosis of breast cancer in younger women［J］.J BUON，2009，14（4）：619-623．

［6］Kapp JM，Yankaskas BC，LeFevre ML.Are mammography recommendations in women younger than 40 related to increased risk?［J］. Breast Cancer Res Treat，2010，119（2）：485-490．

［7］Ruddy KJ，Partridge AJ.Optimizing endocrine therapy in premenopausal ER-positive breast cancer patients［J］.Oncology（Williston Park），2009，23（1）：34-40.

［8］Vrbanec D，Petricevi?B.Estrogen and progesterone receptor status in primary breast cancer--a study of 11，273 patients from the year 1990 to2002［J］.Coll Antropol，2007，31（2）：535-540.

［9］XuBH，JiangZF，ChuaD，etal.Lapatinibpluscapecitabineintreating HER-2-positiveadvancedbreastcancer：efficacy，safety，andbiomarker results fromChinese patients［J］.Chin J Cancer，2011，30（5）：327-335.

［10］李少英，王维，李建梅，等.PIK3CA基因突变与乳腺癌恶性程度和预后的关系［J］.中华肿瘤杂志，2011，33（8）：605-608.

［11］杨丽丽，梁莉萍，赵峰.ER、PR、HER-2、Ki67、Nm23、p53在多中心性乳腺癌中的表达及临床意义［J］.重庆医科大学学报.2012，37（11）：964-967.

［12］Yang JL，Pan XY，ZhaoWX，et al.The antitumor efficacy of a novel adenovirus-mediated anti-p21Ras single chain fragment variable antibody on human cancers in vitroand in vivo［J］.Int J Oncol，2016，48（3）：1218-1228.

［2016-08-29收稿］［2016-09-20修回］［编辑罗惠予］

Effects of taurine on tumor growth in a nude mouse breast cancer model

Song Yumei，He Yu，Liang Boying，Guo Songchao，Ouyang Yiqiang（Department of Nutrition and Food，Hygiene Public Health of Guangxi Medical University，Nanning 530021,P.R.China）
Corresponding author：Guo Songchao.E-mail：2433164518@qq.com

Objective To study the effect of taurine on the humanized nude mouse model of triple-negative breast cancer.Methods Five-week-old SPF level nude mice（n=10）were inoculated with MDA-MB-231 breast cancer cells and randomly divided into one group that

normal drinking water and another group that

water containing 5%taurine（n=5 animals per group）. Tumor volume and weight were examined after treatment,and Western blotting was used to assess expression of estrogen receptor（ER）,progesterone receptor（PR），human epidermal growth factor receptor 2（HER-2）and guanosine triphosphatase-activating protein p21ras.Results All mice survived until the end of the experiment，and all tumors grew.Compared to control mice,mice given taurine had tumors with 41.6%smaller weight and volume（P＜0.05），134%higher expression of ER（P＜0.05）,47.5%higher expression of PR（P＜0.05），67%lower expression of HER-2（P＜0.05）and 62.2%lower expression of p21ras（P＜0.01）.Conclusion Taurine inhibits tumor growth by up-regulating expression of ER and PR and down-regulating expression of HER-2 and p21ras.

Breast neoplasms；Taurine；Antitumor；Nude mice；Estrogen receptor；Progesterone receptor；Human epidemic growth factor receptor 2；Guanosine triphosphatase activating protein

R737.9

A

1674-5671（2016）05-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2016.05.01

广西科技基础条件平台建设项目资助（14-91-02）

郭松超。E-mail：2433164518@qq.com