江西山药茎尖包埋玻璃化法超低温保存及其遗传稳定性检测

尹明华，徐志坚，章省琴，吕思杰，曾艳红，付有章，夏瑾华，洪森荣

(上饶师范学院 生命科学学院，江西 上饶 334001)



江西山药茎尖包埋玻璃化法超低温保存及其遗传稳定性检测

尹明华，徐志坚，章省琴，吕思杰，曾艳红，付有章，夏瑾华，洪森荣*

(上饶师范学院 生命科学学院，江西 上饶 334001)

采用植物组织培养法对广丰药薯茎尖的包埋玻璃化法超低温保存程序进行优化，并采用扩增片段长度多态性(AFLP)分子标记法和流式细胞术对其冻后再生苗的遗传稳定性进行检测，同时将超低温程序应用到江西山药其他地方品种，旨在为薯蓣属植物种质资源的长期保存奠定理论基础。结果表明，广丰药薯茎尖预培养的较佳时间为5 d，较佳的蔗糖浓度为0.75 mol·L-1；装载的较佳时间为40 min；脱水的较佳温度为0 ℃，较佳时间为60 min；冻后黑暗培养7 d可以显著提高其成活率。用AFLP分子标记法和流式细胞术对茎尖冻后再生植株的遗传稳定性进行检测，没有发现异常条带和染色体倍性变化，气孔观察也未发现叶下表皮气孔参数的显著变异。将这种超低温保存程序用于江西山药其他基因型，成活率约为40%～85%。该研究建立的包埋玻璃化法超低温保存程序能保证江西山药的遗传稳定性，可为建立江西山药种质资源超低温保存库提供一定的技术支撑。

江西山药；茎尖；包埋玻璃化法；超低温保存；遗传稳定性

山药是薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(Dioscorea)一年生或多年生缠绕性藤本植物，能形成肥大的地下肉质块茎供为食用或药用，营养价值高[1]。江西是中国正品山药的地道和主要产区之一，出产的山药品质优良，在国内外享有盛誉。江西种植的山药品种繁多，且大多为江西传统名优地方品种，如南城县的南城淮山、瑞昌的瑞昌山药、广丰的千金薯和广丰药薯、泰和竹篙薯等[2-9]。这些山药有些已成为产区的地理标志和品牌性种质资源，其品质和营养成分与怀山药具有显著的差异[10]。目前，江西山药种质资源的繁殖和保存主要采取苗床集中闷种、出苗即栽的方法每年进行田间种植，但由于江西山药地方品种因常年在同一地区甚至同一地块上连作和农民缺乏提纯复壮技术[2]，品种染病和感病害率较高，品种退化严重，病虫害抗性降低，产量较低，而且传统搭架栽培模式不仅费工、费时、费力，而且容易受到自然灾害(如病虫害、冰雪、地震等)的影响[9]。因此，研究江西山药地方品种种质资源的超低温保存具有重要的意义。

超低温保存(cryopreservation)是指将植物材料活体，采取一定的技术，安全存入-196 ℃液氮中长期保存，需要时采取一定的方法使之回到常温并正常生长的一整套生物技术[11]。超低温保存是目前长期保存植物种质资源最有效的方法，已广泛应用于数百种植物[12]。包埋玻璃化超低温保存是20世纪90年代中期兴起的一种新的超低温保存技术，具有毒害性小、设备简单、易于操作、恢复生长快等优点。目前，关于怀山药超低温保存的研究在国内外多有报道[13-17]，但关于江西山药地方品种种质资源的超低温保存尚未见报道。本文先以广丰药薯为研究对象，探讨和优化其包埋玻璃化法超低温保存程序，然后将这种程序应用于江西山药其他地方品种，以期为建立江西山药特异种质资源超低温库提供科学依据和一定的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

广丰药薯、广丰千金薯、瑞昌山药、南城淮山和泰和竹篙薯试管苗均由上饶师范学院生命科学学院植物组织培养室提供。

1.2 方法

1.2.1 广丰药薯茎尖的切取与包埋

将广丰药薯试管苗(培养60 d)的腋芽在10～20倍的双目解剖镜下切取约1～2 mm茎尖(含有3～4叶原基)。(25±1) ℃下将茎尖移入含3%海藻酸钠和0.4 mol·L-1蔗糖的无钙离子改良MS培养基中，注射器吸取茎尖混合物滴入含0.1 mol·L-1CaCl2和0.4 mol·L-1蔗糖的溶液中停留30 min，以充分形成直径约4 mm的球形包埋珠，每包埋珠含有1个茎尖。

1.2.2 广丰药薯茎尖包埋珠的预培养

广丰药薯茎尖包埋珠浸泡于附加有0～1 mol·L-1蔗糖的MS+2 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA培养基中，14 h (L)/10 h (D)光周期下预培养5 d；或广丰药薯茎尖包埋珠浸泡于附加有0.75 mol·L-1蔗糖的MS+2 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA培养基中，置于14 h (L)/10 h (D)光周期下预培养0～7 d，然后将广丰药薯茎尖包埋珠放入含有2 mol·L-1甘油和0.4 mol·L-1蔗糖的MS装载液，(25±1)℃处理40 min，在0 ℃再用PVS2[18](30%甘油+15%二甲基亚砜+15%乙二醇+0.4 mol·L-1蔗糖)脱水60 min后直接投入液氮保存。保存24 h后，包埋珠在37 ℃水浴中化冻3 min，然后用MS+2 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA+1.2 mol·L-1蔗糖的溶液洗涤3次，每次约10 min。去除海藻酸钙包埋物，将包埋珠的茎尖剥离出来，转入MS+2 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA固体培养基上，暗培养7 d后转入14 h (L)/10 h (D)光周期中进行恢复和再生。以茎尖长出新芽为茎尖成活的标志，试验重复3次，统计广丰药薯茎尖的平均成活率，成活率(%)=(玻璃化超低温保存后成活的茎尖数/保存的总茎尖数)×100，筛选出广丰药薯茎尖包埋珠预培养的最佳蔗糖浓度和预培养时间。

1.2.3 广丰药薯茎尖包埋珠的装载

广丰药薯茎尖包埋珠浸泡于MS+2 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA+0.75 mol·L-1蔗糖的培养基中，置于14 h (L)/10 h (D)光周期下预培养5 d，然后将广丰药薯茎尖包埋珠放入含有2 mol·L-1甘油和0.4 mol·L-1蔗糖的MS装载液，(25±1)℃处理0～50 min。然后包埋珠经过脱水、液氮保存、化冻和洗涤后，将包埋珠的茎尖剥离出来，转入MS+2 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA固体培养基上，暗培养7 d后转入14 h (L)/10 h (D)光周期中进行恢复和再生。试验重复3次，统计广丰药薯茎尖的平均成活率，筛选出广丰药薯茎尖包埋珠的最佳装载时间。

1.2.4 广丰药薯茎尖包埋珠的脱水

广丰药薯茎尖包埋珠浸泡于MS+2 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA+0.75 mol·L-1蔗糖的培养基中，置于14 h (L)/10 h (D)光周期下预培养5 d，然后将广丰药薯茎尖包埋珠放入含有2 mol·L-1甘油和0.4 mol·L-1蔗糖的MS装载液，(25±1)℃处理40 min后，0 ℃下用PVS2脱水0～80 min，或25 ℃用PVS2脱水0～60 min后直接投入液氮保存。然后包埋珠经过化冻和洗涤后，将包埋珠的茎尖剥离出来，转入MS+2 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA固体培养基上，暗培养7 d后转入14 h (L)/10 h (D)光周期中进行恢复和再生。试验重复3次，统计广丰药薯茎尖的平均成活率，筛选出广丰药薯茎尖包埋珠脱水的最佳温度和脱水时间。

1.2.5 广丰药薯茎尖包埋珠的冻后培养

广丰药薯茎尖包埋珠经过预培养、装载和脱水、液氮保存、化冻和洗涤后，将包埋珠的茎尖剥离出来，转入MS+2 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA固体培养基上。培养方式为2种：一种是正常的14 h (L)/10 h (D)光周期培养，另一种是先暗培养7 d后转入14 h (L)/10 h (D)光周期中培养。试验重复3次，统计广丰药薯茎尖的平均成活率，筛选出广丰药薯茎尖包埋珠的最佳冻后培养方式。

1.2.6 广丰药薯茎尖冻后再生植株的气孔观察

气孔观察参照陈佰鸿等[19]报道的透明胶带粘取法。用透明胶带粘取再生苗叶下表皮并制片，于显微镜下观测气孔大小(气孔长直径、气孔短直径)、气孔面积(气孔面积=圆周率×长半径×短半径)以及1 000 μm2气孔数(取50个视野)，拍照。

1.2.7 广丰药薯茎尖冻后再生植株的流式细胞仪检测

流式细胞仪(flow cytometry，FCM)检测按照尹明华等[20]建立的方法进行。

1.2.8 广丰药薯茎尖冻后再生植株的AFLP检测

按照郭文等[21]提供的AFLP程序对广丰药薯再生植株进行AFLP分析，步骤如下：DNA样品的制备、接头制作、酶切—连接、预扩增、选择性扩增和非变性胶检测PCR结果。

1.2.9 江西山药基因型对包埋玻璃化法超低温保存的影响

将上述建立和优化的广丰药薯茎尖包埋玻璃化法超低温保存程序应用到江西山药其他基因型上，比较其超低温保存效果的差异。广丰千金薯、瑞昌山药、南城淮山和泰和竹篙薯试管苗茎尖经过包埋、预培养、装载和脱水以及液氮保存后，去除海藻酸钙包埋物，将茎尖转入MS+2 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA固体培养基上，暗培养7 d后转入14 h (L)/10 h (D)光周期中培养。试验重复3次，统计江西山药各基因型茎尖的成活率，比较江西山药基因型对超低温保存的影响。

1.2.10 统计方法

所有数据表示为平均值±标准差，试验数据用SPSS 19.0软件进行One-way ANOVA分析，再进行LSD法检验，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 预培养对广丰药薯茎尖包埋玻璃化法超低温保存的影响

从图1-A可知，预培养5 d时，随着蔗糖浓度的增大，茎尖的冻后成活率也显著提高；蔗糖浓度为0.75 mol·L-1时，茎尖的冻后成活率达到最大值；当蔗糖浓度高于达到1 mol·L-1时，茎尖的冻后成活率开始显著下降。从图1-B可知，蔗糖浓度为0.75 mol·L-1时，预培养1和3 d，茎尖的冻后成活率无显著差异，均显著高于对照组(预培养时间为0 d)；预培养5 d，茎尖的冻后成活率达到最高值，并与预培养1和3 d的成活率有极显著差异；预培养7 d时，茎尖的冻后成活率开始显著下降。因此，MS+2 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA培养基中添加0.75 mol·L-1蔗糖，预培养5 d有助于茎尖的冻后成活。

2.2 装载时间对广丰药薯茎尖包埋玻璃化法超低温保存的影响

从图2可知，含有2 mol·L-1甘油和0.4 mol·L-1蔗糖的MS装载液对于茎尖的冻后成活有显著作用。装载时间为10和20 min时，茎尖的冻后成活率均极显著高于对照。装载时间为30 min时，茎尖的冻后成活率极显著高于10和20 min。装载时间为40 min时，茎尖的冻后成活率达到最高。但装载时间为50 min时，茎尖的冻后成活率极显著下降，下降至装载时间为30 min的水平。

图中不同柱子上无相同大小写字母分别表示在0.01和0.05水平差异显著。下同。图1 预培养基的蔗糖浓度(A)和预培养时间(B)对广丰药薯茎尖包埋玻璃化法超低温保存的影响Fig.1 Effect of sucrose concentration in preculture meidum (A) and preculture time (B) on cryopreservation of Guangfeng medicinal yam shoot-tip by encapsulation-vitrification

图2 装载时间对广丰药薯茎尖包埋玻璃化法超低温保存的影响Fig.2 Effect of loading time on cryopreservation of Guangfeng medicinal yam shoot-tip by encapsulation-vitrification

2.3 PVS2脱水温度和脱水时间对广丰药薯茎尖包埋玻璃化法超低温保存的影响

从图3可知，PVS2脱水温度为0 ℃时，茎尖在20～80 min的冻后成活率为32.8%～43.9%；脱水温度为25 ℃时，茎尖在10～60 min的冻后成活率为14.9%～37.2%，两者差异显著。脱水温度为0 ℃时，PVS脱水时间也会显著影响茎尖的冻后成活，其中脱水60 min有助于茎尖的冻后成活。

图3 PVS2脱水温度和脱水时间对广丰药薯茎尖包埋玻璃化法超低温保存的影响Fig.3 Effect of PVS2 dehydrationon temperature and dehydrationon time on cryopreservation of Guangfeng medicinal yam shoot-tip by encapsulation-vitrification

2.4 冻后培养方式对广丰药薯茎尖包埋玻璃化法超低温保存的影响

14 h (L)/10 h (D)光周期培养和暗培养7 d后转入14 h (L)/10 h (D)光周期培养，成活率分别为32.9%±4.6%和43.7%±4.2%，差异极显著。表明冻后一定时间的黑暗培养可以提高其冻后成活率，同时显著减轻广丰药薯茎尖的褐化。

2.5 广丰药薯茎尖冻后再生植株的气孔观察

在FCM检测之前，对广丰药薯常规继代植株和茎尖冻后再生植株进行气孔观察。结果表明，常规继代植株和茎尖冻后再生植株的叶下表皮气孔参数之间无显著差异(表1，图4)，表明超低温没有造成广丰药薯再生植株的气孔变化，推测不会影响到再生植株的光合生理。

表1 广丰药薯2种再生植株的叶下表皮气孔参数比较

Table 1 Comparison of stomatal parameters of leaf lower epidermis of two kinds of regenerated plantlets of Guangfeng medicinal yam

植株来源气孔长直径/μm气孔短直径/μm气孔长短直径比气孔面积/μm21000μm2气孔数常规继代植株3.9±0.22.3±0.31.70±0.3232.46±0.4242.8±3.8茎尖冻后再生植株3.7±0.92.1±0.41.76±0.2431.21±0.6743.9±2.9

A， 正常继代植株；B， 茎尖冻后再生植株图4 广丰药薯2种再生植株的气孔Fig.4 Stomatal observation of two kinds of regenerated plantlets of Guangfeng medicinal yam

2.6 广丰药薯茎尖冻后再生植株的FCM检测

利用FCM对广丰药薯的母株和茎尖冻后再生植株进行倍性检测，DNA含量分布显示，再生植株的倍性和对照母株相比，PI荧光值曲线相似，峰值相同，没有发现染色体倍性的变化(图5和图6)。因此，广丰药薯茎尖冻后再生植株的倍性是稳定的。

2.6 广丰药薯茎尖冻后再生植株的AFLP检测

采用AFLP技术对广丰药薯常规继代植株和茎尖冻后再生植株进行检测分析，5对引物(E-AAG/M-CAC，E-ACC/M-CTC，E-AGC/M-CTG，E-AGG/M-CAA，E-AGG/M-CTC)的扩增出的总条带数为41，平均每个引物获得8.2个位点，其中28个为可重复的多态性位点，平均每个引物检测到的多态性位点数为5.6个，平均多态性位点百分率为68.29%。其中引物E-AAG/M-CAC的AFLP扩增结果如图7所示。结果表明，在广丰药薯常规继代植株和茎尖冻后再生植株之间没有发现变异位点，说明广丰药薯常规继代植株和茎尖冻后再生植株之间基因组序列保持一致，无可检测到的遗传变异。

A， 广丰药薯常规继代植株；B， 茎尖冻后再生植株图5 广丰药薯FCM检测的直方图Fig.5 FCM histogram of Guangfeng medicinal yam

A， 常规继代植株；B， 茎尖冻后再生植株图6 广丰药薯FCM检测的散点图Fig.6 FCM scatter diagram of Guangfeng medicinal yam

1～2， 常规继代植株；3～10， 茎尖冻后再生植株图7 广丰药薯基因组的AFLP扩增结果Fig.7 Profiles of AFLP of the Guangfeng medicinal yam

2.7 江西地方山药基因型对包埋玻璃化法超低温保存的影响

江西地方山药不同基因型包埋玻璃化法超低温保存的效果见图8。从图8可知，广丰药薯建立的茎尖包埋玻璃化法超低温保存可以应用到广丰千金薯、瑞昌山药、南城淮山和泰和竹篙薯的种质资源保存中，成活率为46.8%～69.5%。其中，广丰千金薯和泰和竹篙薯的成活率最高，南城淮山的成活率最低，与广丰药薯的成活率相比无显著差异(P>0.05)。

图8 江西地方山药不同基因型包埋玻璃化法超低温保存效果比较Fig.8 Comparison of cryopreservation by encapsulation-vitrification effects of different genotypes of Jiangxi local yam

3 讨论

包埋玻璃化法超低温保存的第1步是对材料进行预培养。研究表明，用较高浓度的蔗糖预培养数天，可以使材料预先脱除部分水分，提高茎尖胞质浓度，从而增加抗冻力，促进茎尖冻后的成活[22]。扁桃茎尖包埋珠在含有 0.3 mol·L-1蔗糖和50 g·L-1DMSO(二甲基亚砜)的MS培养基预培养1 d，成活率高达52%[23]，但扁桃休眠茎尖包埋珠在含有0.5 mol·L-1蔗糖的MS培养基预培养3 d，成活率可达到45%，究其原因是休眠茎尖经过冬天的低温，已形成了保护性物质(如可溶性糖和脯氨酸等)，导致其耐冻能力增加，所以利用0.5 mol·L-1蔗糖进行预培养可以代替0.3 mol·L-1蔗糖和50 g·L-1DMSO的预培养效果；而预培养时间从1 d增加到3 d，可能是增加预培养时间也可代替DMSO的预培养效果。本试验也表明，MS+2 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA培养基中添加0.75 mol·L-1蔗糖，预培养5 d有助于广丰药薯茎尖的冻后成活。

包埋玻璃化法超低温保存的第2步是装载液的装载。装载液一般为2 mol·L-1甘油和0.4 mol·L-1蔗糖[24]。前人的研究表明，使用甘油和蔗糖的装载处理可以减轻后续步骤的玻璃化液即PVS2的毒害作用。本试验表明，用含有2 mol·L-1甘油和0.4 mol·L-1蔗糖的MS装载液对广丰药薯茎尖装载30 min，对其冻后成活有极显著的促进作用。这与扁桃[23]和李[25]茎尖包埋珠的装载条件较为一致。用改良的装载液对树莓茎尖包埋珠进行装载，即用含2 mol·L-1甘油和0.9 mol·L-1蔗糖的装载液处理90 min，成活率也可显著提高，达85%[26]。因此，装载液成分的浓度以及装载液的装载时间因植物种类而异[27]。

包埋玻璃化法超低温保存的第3步是冰冻保护剂的脱水。冰冻保护剂一般用PVS2[18]，由于PVS2的毒害效应，因此，要适度把握好PVS2的脱水时间和脱水温度，PVS2脱水温度一般设置为0 ℃或25 ℃[28]。研究表明，25 ℃时，脱水时间可适量减少；0 ℃时，时间可适当延长[29]。在0 ℃条件下，扁桃[23]、青岛百合[30]、李[25]和树莓[26]茎尖包埋珠PVS2的处理时间分别延长到50，60，120和180 min，成活率均可显著提高。本试验结果也表明，广丰药薯茎尖25 ℃处理40 min，成活率为37.2%，而0 ℃处理时，脱水时间需要延长到60 min，但成活率可显著提高到43.9%。

包埋玻璃化法超低温保存的最后一步是冻后材料的再生。研究表明，超低温保存后适当的黑暗培养可以修复材料在超低温保存期间造成的伤害。扁桃[23]和青岛百合[30]茎尖超低温保存后转接至恢复培养基上暗培养一段时间，均可促进成活率的增加。本试验结果也表明，冻后一定时间的黑暗培养可以显著减轻广丰药薯茎尖的褐化，提高其冻后成活率。还有研究表明，超低温保存后材料的成活率也会因山药基因型而异[16]。本试验结果也支持了这种观点。究其原因，这种差异可能与不同品种的遗传差异有关。

植物材料DNA和染色体倍性的稳定性是植物种质资源保存的一个重要的问题。因此，建立和优化超低温保存程序后，一般还需要对其再生植株的遗传稳定性进行检测和分析。目前，遗传稳定性的检测和分析多采用分子标记(如RAPD，AFLP，ISSR等)和细胞流式术(FCM)。朱文涛等[31]和陈冠群等[32]分别运用AFLP技术分析了五叶草莓和百子莲超低温后的DNA带型，均未发现明显差异片段，表明超低温保存前后的五叶草莓和百子莲没有发生遗传变异。本研究中AFLP分析未检测到位点变异，表明超低温冻存的广丰药薯再生植株无DNA变异。Zarghami等[33]用AFLP检测了3个马铃薯品种冻后再生植株的DNA变异，发现2个品种即Agria和Marphona未检测到变异，而Agria的3% AFLP位点为多态性位点，但作者也指出，这种变异可能并非来自冷冻伤害，也许是不同品种对离体培养的反应不同造成的。本研究利用流式细胞仪对广丰药薯冻后再生植株的染色体倍性进行鉴定，未见染色体倍性变异。这与Schäfer-Menuhr等[34]和Galdiano等[35]在马铃薯和文心兰上的染色体倍性鉴定结果是一致的。

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(责任编辑 侯春晓)

Cryopreservation of Jiangxi yam shoot-tip by encapsulation-vitrification and its detection of genetic stability

YIN Ming-hua， XU Zhi-jian， ZHANG Sheng-qin， LYU Si-jie， ZENG Yan-hong， FU You-zhang， XIA Jin-hua， HONG Sen-rong*

(CollegeofLifeSciences，ShangraoNormalUniversity，Shangrao334001，China)

In this paper， cryopreservation procedure of Guangfeng medicinal yam shoot-tip by encapsulation-vitrification would be optimized by the method of plant tissue culture， and the genetic stability of regenerated plantlets after cryopreservation would be tested with AFLP molecular markers and flow cytometry methods. At the same time， this cryopreservation procedure by encapsulation-vitrification would be applied to other local varieties of Jiangxi yam， in order to lay the theoretical and technical foundation for long-term conservation of genusDioscoreagermplasm. The results showed that: The better pre-culture time of Guangfeng medicinal yam shoot-tips was 5 d， the better sucrose concentration in pre-culture medium was 0.75 mol·L-1; The better loading time was 40 min; The better dehydration temperature was 0 ℃， the better dehydration time was 60 min; 7-day dark culture could significantly improve the survival rate of shoot-tips after cryopreservation. At last， the genetic stability of regenerated plants was detected by AFLP molecular marker and flow cytometry (FCM)， and no abnormal bands and chromosome ploidy changes were found. At the same time， no significant variation of stomatal parameters of leaves was observed. The cryopreservation technique was used in other genotypes of Jiangxi yam， the survival rate was about 40%-85%. Therefore， cryopreservation procedure by encapsulation-vitrification could guarantee the genetic stability of Jiangxi yam germplasm resources. The results of this study provided a certain technical support for the establishment of cryopreservation bank of Jiangxi yam germplasm resources.

Jiangxi yam; shoot-tip; encapsulation-vitrification; cryopreservation; genetic stability

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.13

2015-11-22

国家自然科学基金(31360072);江西省教育厅2014年度科学技术研究一般项目(GJJ14712)；国家级大学生创新创业训练计划项目(201410416003)

尹明华(1973—)，女，江西永新人，硕士，副教授，从事植物生物技术方面的研究。E-mail：yinminghua04@163.com

*通信作者，洪森荣，E-mail：hongsenrong@163.com

S632.1

A

1004-1524(2016)06-0984-08

尹明华， 徐志坚， 章省琴， 等. 江西山药茎尖包埋玻璃化法超低温保存及其遗传稳定性检测[J]. 浙江农业学报， 2016， 28(6): 984-991.