基于ISSR分子标记的茶树品系丽早香遗传特性分析

潘建义 ，成 浩，王丽鸳，马军辉

(1.浙江省丽水市农业局农作物站，浙江 丽水323000； 2.中国农业科学院 茶叶研究所/国家茶树改良中心，浙江 杭州 310008)



基于ISSR分子标记的茶树品系丽早香遗传特性分析

潘建义1，成 浩2，*，王丽鸳2，马军辉1

(1.浙江省丽水市农业局农作物站，浙江 丽水323000； 2.中国农业科学院 茶叶研究所/国家茶树改良中心，浙江 杭州 310008)

丽早香是浙江省丽水市选育的茶树品系，研究其遗传特性及与其他茶树品种差异性，是申请植物新品种保护和开展新品种审定的重要判定依据。以浙江丽水主栽品种嘉茗1号(乌牛早)、迎霜、龙井43和当地群体种(鸠坑)为比较对象，采用改进的CTAB法提取上述4个品种和丽早香(山地种和大田种)6个材料的总DNA，应用简单重复区间序列(ISSR)标记的方法，分析了丽水本地品系丽早香的遗传特性。结果表明：丽早香在不同栽培环境中基因型没有差异，是一个稳定的品系；而且，丽早香与嘉茗1号(乌牛早)的亲缘关系最近，与龙井43的亲缘关系最远，与迎霜和当地群体种的亲缘关系介于两者之间。

丽早香；ISSR；遗传多样性；亲缘关系

简单重复区间序列(inter-simple sequence repeat，ISSR)标记是以加锚SSR(simple sequence repeats)寡聚核苷酸为引物，对位于反向排列的SSR之间的DNA序列进行PCR扩增的一种分子标记技术。许多研究表明，应用分子标记建立指纹图谱是进行作物品种鉴别的有效工具。在茶树资源上，已采用RAPD，AFLP，RFLP和ISSR等标记技术进行遗传多样性、亲缘关系分析以及品种资源的分子鉴别研究[1-7]。

丽早香是浙江省丽水市选育出来的早生茶树品系，几年来以其早生优质，特别适合采制螺形名茶、半烘炒香茶和扁形名茶等名优绿茶而深受当地茶农青睐。该品系在生产中为茶农带来了高收益，具有较大开发利用价值。为了更好地推广应用该品系，本试验应用ISSR分子标记技术对丽早香与丽水市主栽品种的遗传差异进行了比较研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料采自浙江省丽水市莲都区老竹镇狮子山村，并用本地主栽品种嘉茗1号(乌牛早)、迎霜、龙井43和当地群体种(鸠坑)4个品种作为对照，采摘1芽3叶鲜叶，-20 ℃保存备用。

1.2 引物

参照刘本英等[8]采用的引物，由上海生物工程技术服务公司合成。

1.3 试验方法

1.3.1 基因组的提取、检验

采用CTAB改进法提取DNA，具体参照刘本英等[8]方法。纯化DNA并稀释100倍，采用分光光度计测定D260和D280值，以确定DNA纯度和浓度；DNA样品在0.8%琼脂糖凝胶上电泳(电压2～5 V·cm-1，终浓度为0.6 μg·mL-1的EB染色)，然后在Bio-Rad凝胶成像仪上检验DNA质量。将DNA配制成浓度为40 ng·μL-1的模板DNA[8]。

1.3.2 ISSR-PCR方法和产物检测

ISSR-PCR 10 μL反应体系：1.0 μL 40 ng·μL-1模板DNA、0.6 μL 10 μmol·L-1引物、1.0 μL 10×PCR反应缓冲液、0.8 μL 25 mmol·L-1Mg2+、0.2 μL 10 nmol·L-1dNTP，0.1 μL 5 UTaqDNA聚合酶(Promega) 、6.3 μL ddH2O。

PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；然后进入下列循环：94 ℃变性1 min，52～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，39个循环；循环结束后72 ℃延伸7 min。扩增后PCR产物在4 ℃保存。产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压150 V，4 h)检测，银染显色，用Bio-Rad凝胶成像仪拍照记录。

语相指的是整个书写系统，包括拼写、标点符号、段落编排等。刘世生把书写系统定义为语言的视觉中介，即标点、排版、字母和段落结构，以及诗歌中的长短行，还包括图画和图像[7]。语相跟文体有密切的联系，语相的特殊效果可以表达一些用常规的方式无法得到的意义。

1.3.3 数据处理与分析

用DL2000作为分子量标记，全部材料在重复扩增中稳定出现条带赋值为1，不出现赋值0，统计结果用于聚类分析；扩增结果采用Nei相似系数(GS)的计算方法，得到供试材料相似性矩阵，应用公式GD=1-GS计算出遗传距离矩阵，采用UPGMA聚类分析方法构建分子系统树状图[8]。利用Popgene32 和NTSYS-pc 2.1软件进行数据统计。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的提取与检验

采用改良的CTAB法得到的总DNA，检测谱带清晰，亮度好(图1)，D260/D280值(吸光法检测)在1.82～1.87之间，平均1.84，提取的总DNA纯度好、质量较高，可用于ISSR分子标记分析。

2.2 ISSR-PCR扩增分析

前后选用15对ISSR引物对2个丽早香样本及4个对照品种样本进行扩增，4对引物能有效地区分6个样本(图2)。其中，丽早香大田样与山地样的扩增谱带基本一致，说明该材料在不同栽培环境中基因型没有变化，是一个稳定的品系；而丽早香扩增谱带与4个对照品种样品明显不同，说明它们在遗传组成上确有差异。

2.3 遗传距离与遗传一致度分析

对6个样本遗传距离的分析结果表明，6个材料间的遗传距离范围在0.113 3～0.387 8之间，平均为0.280 0。丽早香与迎霜、嘉茗1号(乌牛早)之间的遗传距离较小，而与龙井43之间的遗传距离最大，为0.387 8，表明它们之间的遗传差异明显(表1)。6个样本的遗传一致度范围在0.678 6～0.892 9之间，平均为0.760 0。与遗传距离的结果相一致，丽早香与龙井43之间的遗传一致度最小，为0.678 6，与龙井43和迎霜等其他3个样本间的遗传一致度比龙井43更大一些(表1)。

1.当地群体种(鸠坑)；2.丽早香(山地)；3.嘉茗1号(乌牛早)；4.迎霜；5.丽早香(大田)；6.龙井43。下同。图1 六个样本DNA电泳图谱Fig.1 DNA electrophoresis of 6 samples

图2 四个能有效区分6个样本的引物的PCR电泳图谱Fig.2 ISSR PCR fingerprints of 6 samples of tea using 4 primes

利用ISSR标记数据计算出6个样本间的遗传相似系数，并采用UPGMA法构建6个样本的遗传关系聚类图(图3)。从相似系数分析可以看出，除2个丽早香样本外，嘉茗1号与丽早香的相似系数(分别为0.847 290 6和0.858 490 6)为所有对照材料中最高的，表明嘉茗1号与丽早香之间的亲缘关系较其他材料可能更近一些(表2)。

表1 六个样本的Nei遗传距离(对角线下方)和遗传一致度(对角线上方)

Table 1 Neil’s genetic distances (below the diagonal) and genetic identity (above the diagonal) of 6 samples

样本1234561****0.71430.77860.79290.73570.721420.3365****0.77860.79290.89290.678630.25030.2503****0.75710.78570.757140.23210.23210.2782****0.75710.700050.30690.11330.24120.2782****0.714360.32650.38780.27820.35670.3365****

图3 六个样本基于ISSR标记的聚类图Fig.3 Dendrogram for tea genotypes obtained using the unweighted pair group method with arithmatic average (UPGMA) of 6 tested samples based on ISSR polymorphism

表2 六个样本的相似系数

Table 2 Genetic similarity of 6 samples

样本12345611.000000020.80769231.000000030.83581400.84729061.000000040.83853660.83974090.83000001.000000050.82949310.92682930.85849060.83168321.000000060.82352940.78468900.84259260.79611650.81651381.0000000

由聚类图可以清晰地看到，当以相似系数0.846(划线处)划分时，6个茶树样本在树状图上聚为1，2和3等3个类群，其中1类群有当地群体种(鸠坑)和迎霜2个品种；2类群包括嘉茗1号(乌牛早)和聚在一起的2个丽早香样本，说明2个丽早香样本在基因型上没有差异，与嘉茗1号(乌牛早)的亲缘关系相对较近；3类群为龙井43，单独聚为一类群，表明该品种与其他5个样本有较大的遗传距离，亲源关系较远。

3 讨论

采用改进的CTAB法提取了6个样本的总DNA，进行了ISSR-PCR扩增，共有10对引物表现良好的多态性，采用其中4对引物能有效地将丽早香与其他作为对照的4个品种区别开来。根据扩增结果数据，进行了遗传距离、遗传一致度和相似系数计算，并依据相似系数进行了聚类分析。所有结果具有良好的一致性，丽早香与嘉茗1号(乌牛早)的亲缘关系最为接近，与龙井43的亲缘关系相对最远，与迎霜和当地群体种(鸠坑)的亲缘关系介于两者之间。

[1] 陈志辉，单睿阳，林郑和，等.利用SSR标记分析福建省选育福云半同胞系茶树品种遗传多样性[J].茶叶学报，2015，56(4)：238-243.

[2] 王让剑，杨军，孔祥瑞，等.福建15个茶树品种SSR遗传差异分析与指纹图谱建立[J].福建农业学报，2014(10):970-975.

[3] 刘本英，王平盛，季鹏章，等.云南特有茶组植物遗传多样性的ISSR研究[J].云南农业大学学报，2008，23(3): 302-308.

[4] 刘本英，成浩.分子指纹图谱技术及其在茶树品种资源中的应用[J].茶叶，2007，33(4)：198-202.

[5] 姚明哲，陈亮，王新超，等.我国茶树无性系品种遗传多样性和亲缘关系的ISSR分析[J].作物学报，2007，33(4):598-604.

[6] 陈亮，杨亚军，虞富莲.应用RAPD标记进行茶树优异种质遗传多态性、亲缘关系分析与分子鉴别[J].分子植物育种，2004，2(3)：385-390.

[7] 陈海军，赵东，刘祖生.浙江部分茶树良种的RAPD分子鉴定[J].茶叶，2002， 28(4):197-198.

[8] 刘本英，孙雪梅，汪云刚，等.绿茶DNA提取方法及分子鉴定的初步研究[J].中国农学通报，2010，26(3):37-41.

(责任编辑 张 韵)

Analysis of genetic characteristics in tea line Lizaoxiang based on ISSR markers

PAN Jian-yi1， CHENG Hao2，*， WANG Li-yuan2， MA Jun-hui1

(1.CropWorkstationofAgriculturalBureauofLishui，Lishui323000，China; 2.TeaResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences，NationalCenterforTeaImprovement，Hangzhou310008，China)

Lizaoxiang is a tea line bred in Lishui City， Zhejiang Province， whose genetic characteristics and diversity with other tea cultivars were the important basis for the examination of new varieties. The local major tea cultivars such as Jiaming No.1(Wuniuzao)， Yingshuang， Longjing 43 and Jiukeng were selected as experimental materials， and the total DNA of 6 materials including the above four cultivars and Lizaoxiang(mountain land type and field land type)were extracted using improved CTAB method and the genetic diversity and relationship of Lizaoxiang were analyzed using inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. The results indicated that Lizaoxiang is a stable tea line without variation in DNA profiles in different cultivation environment. Phylogenetic relationships revealed that Lizaoxiang was closest to Jiaming No.1 (Wuniuzao) but farthest from Longjing 43， while Yingshuang and Jiukeng were in between.

Lizaoxiang; ISSR; genetic diversity; genetic relationship

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.15

2016-03-25

浙江省茶产业重点科技创新团队项目(2011R50024)；丽水市优质特早红绿兼制型茶树新品种选育研究项目(2014XPZ11)

潘建义(1968—)，男，浙江温州人，硕士，高级农艺师，从事茶叶技术推广及茶树品种研究。E-mail：pjy369@126.com

*通信作者，成浩，E-mail：chenghao@mail.tricaas.com

S571.1

A

1004-1524(2016)06-0999-04

潘建义，成浩，王丽鸳，等. 基于ISSR分子标记的茶树品系丽早香遗传特性分析[J]. 浙江农业学报，2016，28(6)： 999-1002.