褪黑素受体Mel1a在鸭不同组织中的表达研究

王淑娟，刘文举，刘晓丽，王立克，庞训胜

(1.安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100； 2.华中农业大学 动物医学院，湖北 武汉 430070)



褪黑素受体Mel1a在鸭不同组织中的表达研究

王淑娟1，刘文举1，刘晓丽2，王立克1，庞训胜1

(1.安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100； 2.华中农业大学 动物医学院，湖北 武汉 430070)

褪黑素是由松果体分泌的吲哚类激素，褪黑素通过与其受体(Mel-1a， Mel-1b and Mel-1c)结合发挥对动物的节律性，生殖调控，抗凋亡和抗氧化等调节作用。为探究Mel1amRNA和Mel1a蛋白在鸭不同组织中的表达与分布以及在各个组织的相对表达量，研究褪黑素通过Mel1a受体参与鸭的生殖调控作用及其他生物学效应奠定基础，采集鸭心、脾、大脑、小脑、肾、肝、肺、胰和骨骼肌肉组织，利用PCR、免疫组织化学和RT-PCR技术研究Mel1amRNA和Mel1a蛋白在鸭各组织中表达分布以及Mel1amRNA的相对表达量。研究结果表明：鸭Mel1amRNA在心、脾、大脑、小脑、肾、肝、肺、卵巢、胰和骨骼肌组织中均存在表达；Mel1a蛋白在大脑、肺、肝、骨骼肌、肾、心和胰组织中均有表达；Mel1amRNA定量结果表明，各组织中的Mel1amRNA表达量存在差异，大脑、肺、卵巢、脾、小脑和胰脏的相对表达量较高，而肝、骨骼肌、肾和心的相对表达量较低。褪黑素首先通过与其受体结合而发挥生理调控功能，所以通过研究Mel1amRNA和蛋白在不同组织的表达分布及其相对表达量，为研究褪黑素及其受体的生理功能如调控昼夜节律，抗凋亡、抗氧化、增强免疫力、卵母细胞成熟以及胚胎的发育探究提供基础。

鸭；褪黑素受体1a；免疫组织化学；组织表达；荧光定量PCR

褪黑素是由松果体分泌的具有多种生物功能的吲哚类激素，并且在调控动物昼夜节律及季节性繁殖动物的生殖活动等功能具有重要的作用[1-3]。光照对褪黑素的分泌具有抑制作用，白天血液中的褪黑素的浓度要低于夜间。褪黑素发挥其多种生物学功能前提是与其受体相结合，随着人们研究的不断深入，褪黑素受体的相关信息已日益完善。褪黑素受体属于G-蛋白偶联受体家族[4-5]。在脊椎动物中褪黑素受体存在3种亚型，分别为Mel1a，Mel1b和Mel1c[6]；然而在哺乳动物中只存在2种褪黑素受体，分别为MT1和MT2，哺乳动物的MT1和MT2分别与脊椎动物中的Mel1a和Mel1b相对应[7-8]。在哺乳动物中缺失Mel1c，这可能是物种在进化过程中发生了基因的丢失。近来也有研究认为哺乳动物中存在第3种褪黑素受体，NQO2(醌类还原酶)被认为是哺乳动物的第3个褪黑素受体，但是NQO2不是G-蛋白偶联受体家族，并且NQO2在仓鼠和兔中存在表达，而在人类中并没有发现这种受体[9-11]。也有研究者把与褪黑素受体具有同源性的GPR50 (G protein-coupled receptor 50)作为哺乳动物的第3种受体，但是研究认为GPR50并不与褪黑素相结合，可能与MT1以异二聚体的形式相结合，从而抑制褪黑素受体MT1的活性[12-13]。Mel1a主要表达于各个物种的中枢神经系统和外周组织[4，14]。Natesan等[15]对鸡的神经组织研究表明Mel1a，Mel1b和Mel1c均表达于神经组织。Rada等[16]运用免疫组化和western blot的方法研究表明在鸡的眼球中存在Mel1a，Mel1b和Mel1c的表达，并且主要分布于角质层、脉络膜、巩膜和视网膜。然而Adachi 等[7]通过培养星形胶质细胞研究褪黑素受体的表达分布，只有Mel1a和Mel1c 2种受体，而不存在Mel1b受体。Sallinen等[17]研究兔的Mel1a mRNA 组织分布表明褪黑素受体均表达于视网膜，心肌、肝脏、哈德泪腺和小肠组织中。在哺乳动物中的研究发现Mel1a在视交叉上核、垂体和生殖系统具有较高的表达水平，这可能有褪黑素发挥生理调控机能有关[18]。Mel1a也表达于金鱼的各组织中，并且在脑和视网膜的表达量明显高于其他组织[19-21]。Mel1a表达于脑部，如下丘脑、顶盖前区和视顶盖，这可能与Mel1a参与视觉信息的呈递有关[22]。

褪黑素具有广泛的生物学功能，特别是对动物的生殖生理具有重要的调控作用。褪黑素及其受体在鸭上的研究比较少，而研究褪黑素功能的基础是褪黑素受体的组织表达分布，研究褪黑素受体的表达分布为研究褪黑素的功能以及不同组织的表达调控具有重要的意义，本研究基于此利用免疫组织的方法研究Mel1a受体蛋白在鸭不同组织的表达分布以及RT-PCR的方法研究Mel1a的mRNA在鸭不同组织的表达分布及相对表达量，为研究Mel1a对鸭的生物学作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验对象

选取产蛋期母鸭6只，取新鲜的心、脾、大脑、小脑、肾、肝、肺、胰和骨骼肌肉组织于液氮中保存备用，用于提取RNA；同时采取大脑、肺、肝、骨骼肌、肾、心和胰组织固定在多聚甲醛中用于免疫组化分析。

1.2 主要试剂

总RNA提取试剂盒购自北京天根(中国北京)、反转录试剂盒购自fermentas(美国)、TaqDNA 聚合酶等购自北京天根(中国北京)、dNTP Mix购自天根公司(中国北京)、免疫组化试剂盒购自武汉博士德(中国武汉)、褪黑素受体A购自北京博奥森(中国北京)，荧光定量试剂购自罗氏公司(德国)。

1.3 总RNA提取与反转录

将保存在液氮中的心、脾、大脑、小脑、肾、肝、肺、胰和骨骼肌组织分别取出约50 mg，在加有液氮的研钵中用研棒研成粉末状。然后将组织粉末转移到裂解液中，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，提取的总RNA溶于50 μL RNasefree-H2O中，-80 ℃超低温冰箱中保存备用。将提取的各组织的总RNA，用反转录试剂盒反转录成cDNA。反转录程序及条件：5.0 μL总RNA、0.5 μL Oligo(dT) 引物和6.5 μL RNasefree-H2O，65 ℃ 5 min，迅速置于冰上预冷2 min；然后加入5.0 μL M-MLV RT 5×缓冲液、1.25 μL dNTP、0.5 μL RNA酶抑制剂和1 μL 反转录酶，42 ℃ 60 min，72 ℃ 10 min，得到鸭各组织的cDNA，置于-20 ℃冰箱备用。

1.4 PCR引物设计

参考GenBank报道的原鸡(Gallusgallus)(gi4538-2490)、小白鹭(Egrettagarzetta)(GI:697840607)、红喉潜鸟(Gaviastellata)(GI:698414251)、斑尾非洲咬鹃(Apalodermavittatum)(GI:699600918)、双领鸻(Charadriusvociferus)(GI:699659678)、绒啄木鸟(Picoidespubescens)(GI:699670255)、麝雉(Opisthocomushoazin)(GI:700395793)、啄羊鹦鹉(Nestornotabilis)(GI:701302251)和红冠蕉鹃 (Tauracoerythrolophus)(GI:701333387)Mel1a基因序列，针对序列保守区域利用Primer 5.0软件优化设计1对引物。引物由上海生工公司合成，见表1。

1.5 鸭Mel1a基因扩增及鉴定

以反转录的鸭脑组织的cDNA第1链为模板进行基因的扩增，PCR反应体系为：1.0 μL cDNA、10 mmol·L-1正向引物和反向引物各0.5 μL、10 mmol·L-1dNTP 0.5 μL、2.5 μL 10×Buffer、0.5 μLTaq酶(5 U·μL-1)，加ddH2O补至25.0 μL。

表1 鸭Mel1a和GAPDH基因扩增引物

Table 1 The PCR primer for theMel1aandGAPDHgenes

基因引物退火温度/℃Mel1a5'-GGGCCTAAGTGTCATTGGAT-3'585'-AGTAACTATGGCTATGGGAAG-3'GAP-DH5'-GTGGTGCAAGAGGCATTGCT-GAC-3'585'-GCTGATGCTCCCATGTTCGTGAT-3'

反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，进行35个循环；最后72 ℃延伸10 min，PCR产物保存在4 ℃。PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察目的片段。用凝胶试剂盒回收目的片段，并与克隆载体Pmd-18T连接，并转化感受态细胞，铺LB固体培养基平皿，挑取单菌落培养，以菌液为模板，用鸭Mel1a基因引物进行扩增，观察是否有目的片段，挑选阳性菌液，送上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.6 Mel1a mRNA组织表达

以反转录的鸭各组织的cDNA第1链为模板进行目的基因的扩增，PCR反应体系和反应条件同1.5节，检测各组织中Mel1amRNA的表达。

1.7 免疫组化

免疫组化检测鸭大脑、肺、肝、骨骼肌、肾、心和胰组织Mel1a蛋白的表达，大脑、肺、肝、骨骼肌、肾、心和胰组织经固定、包埋、切片、烤片；60 ℃恒温箱中烘烤120 min、脱蜡和水化；二甲苯(20 min)→二甲苯(20 min)→无水乙醇(5 min×2次)→95%乙醇(5 min×2次)→90%乙醇(5 min)→80%乙醇(5 min)，并依次滴加抗原修复液、3%过氧化氢、5%脱脂奶粉封闭液、兔抗Mel1a多抗，再滴加生物素化山羊抗兔二抗，DAB显色，苏木精复染细胞核1 min，盐酸乙醇分化、脱水、透明、封片。显微镜下观察Mel1a蛋白的表达情况。

1.8 Mel1a基因定量检测

Mel1a引物见表1，在荧光定量PCR 10.0 μL反应体系中加入5.0 μL含绿色荧光的2×Mix Buffer，稀释5倍后的样品cDNA 2.0 μL为模板，10 mmol·L-1的引物0.5 μL，补充ddH2O补至10.0 μL，分别扩增目的基因和内参基因，然后进行荧光定量PCR程序(表2)。每个样本重复3次，反应程序如表2所示。

1.9 统计分析

采用LightCycler 480系统软件分析荧光定量PCR数据，以大脑基因表达量为参照，应用2-ΔΔCt方法分析Mel1a基因在其他组织的相对表达量。

表2 荧光定量PCR反应程序

Table 2 Reaction program of real-time PCR

反应步骤温度/℃时间/s循环次数/次荧光信号预孵育95301无955扩增582045在延伸阶段结束时7220熔解曲线60251在温度缓慢升高过程中冷却40101无

采用SPSS 11.0计算重复样品之间Ct均值以及标准差，最后使用Excel绘制Mel1a基因在鸭各组织中的相对表达柱状图。

2 结果与分析

2.1 鸭组织总RNA的提取

提取的鸭组织总RNA用琼脂糖凝胶电泳检测质量，图1中28S条带亮度高于18S，当28S条带的亮度约为18S亮度的2倍时，表明提取的RNA质量较好，并且没有出现5S，表明RNA无降解，可进行下一步实验。

2.2 鸭Mel1a基因扩增

用设计的鸭Mel1a基因引物(表1)，以鸭脑cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物大小与预期大小相符，为292 bp(图2)。测序结果表明，PCR扩增的Mel1a基因序列与GenBank中其他物种的Mel1a同源性很高。

2.3 Mel1a mRNA组织表达谱

以鸭心、脾、大脑、小脑、肾、肝、肺、胰和骨骼肌cDNA为模板，用设计的鸭Mel1a基因引物，进行PCR扩增，PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果表明鸭Mel1amRNA在鸭的各组织中均表达，但在不同组织中的表达量存在差异，脾、心、小脑、卵巢和肝的表达量相对较高，而骨骼肌的表达量相对较低(图3)。

图1 鸭组织总RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from duck tissues

M: Marker 1DNA分子标记；1～5: Mel1a PCR 产物图2 鸭Mel1a基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of Mel1a detected by PCR

图3 Mel1a基因和内参基因(GAPDH)在鸭组织中的表达Fig.3 The expression of Mel1a and GAPDH at mRNA level in duck tissues

A， 大脑；B， 肺；C， 肝；D， 骨骼肌；E， 肾；F， 心；G， 胰图4 鸭Mel1a受体蛋白在各组织中表达分布Fig.4 The expression of Mel1a in duck tissues

2.4 Mel1a受体蛋白在不同组织的表达

免疫组化结果与Mel1amRNA组织表达谱相似，鸭Mel1a受体蛋白在大脑、肺、肝、骨骼肌、肾、心和胰组织中均存在表达(图4)。

2.5 Mel1a mRNA在不同组织中的相对表达量

利用荧光定量PCR来检测Mel1amRNA在各组织的相对表达量，以GAPDH基因作为内参基因，以大脑基因表达量为对照，分析Mel1a基因在鸭其他10种组织中的相对表达量，结果见图5。Mel1a基因在所检测的组织中均存在表达，其中大脑、肺、卵巢、脾、小脑和胰脏的相对表达量较高，而肝、骨骼肌、肾和心的相对表达量较低。

图5 鸭Mel1a基因 mRNA相对定量结果Fig.5 The relative expression of Mel1a mRNA in duck tissues

3 讨论

褪黑素是由松果体分泌的，在调控生殖生理功能中具有重要作用的吲哚类激素，褪黑素通过与其受体结合发挥调控作用。本研究以鸭不同组织的Mel1a为研究对象，利用PCR和免疫组化的方法研究Mel1amRNA和蛋白在鸭不同组织中的表达分布，以及应用定量PCR的方法研究Mel1amRNA在鸭不同组织中的相对表达量，研究结果表明鸭Mel1amRNA在心、脾、大脑、小脑、肾、肝、肺、卵巢、胰和骨骼肌组织中均存在表达；Mel1a受体蛋白均表达于大脑、肺、肝、骨骼肌、肾、心和胰组织中；Mel1amRNA定量结果表明各组织中的Mel1amRNA表达量存在差异，在大脑、肺、卵巢、脾、小脑和胰脏的相对表达量较高，而肝、骨骼肌、肾和心的相对表达量较低。褪黑素受体在鸭组织表达的广泛性以及不同的表达量，表明褪黑素及其受体在不同组织中发挥不同的调控作用，如抗凋亡、抗氧化和免疫调节。

Mel1amRNA和蛋白在部分物种中的表达已经被鉴定，然而关于鸭的各个组织的研究还尚未见报道。Natesan等[15]对鸡的Mel1amRNA在视网膜的表达分布研究表明Mel1a表达于光感受器，视网膜的内核层以及视网膜的神经节细胞层。Rada等[16]研究表明鸡的眼球中存在Mel1a受体，主要分布于角质层、脉络膜、巩膜和视网膜然，在夜晚表达量最高，褪黑素受体在眼球中表达特别是视网膜中表达与褪黑素通过受体调控昼夜节律有关。Sallinen等[17]研究表明兔的Mel1amRNA表达于下丘脑，视网膜，心肌、肝脏、哈德泪腺和小肠组织中，下丘脑中Mel1amRNA白天和昼夜表达差异显著。Mel1a表达于金鱼的脑、视网膜、肝脏和肾脏组织中，并且在脑和视网膜的表达量明显高于其他组织[20]。Mel1a也表达于鱼脑部，如下丘脑、顶盖前区和视顶盖，这可能与Mel1a参与视觉信息的呈递有关[22]。Iigo等[23]研究表明褪黑素在神经系统具有较多的结合位点。本研究与以上研究相符合，与其他组织相比Mel1a在神经系统具有较高的表达水平。Mel1a在神经系统的表达与其调控动物的昼夜节律功能有着重要的关联，同时Mel1a通过视网膜感受外界光照的变化，参与光信号的呈递使动物的生理行为呈现一定的节律性以及调节睡眠和神经细胞的凋亡有关[24-25]。褪黑素还可以调节脑垂体释放促黄体素和生长激素，并且在神经内分泌的调控中具有重要的作用[1，26-27]。

褪黑素受体同样在鸟类的免疫器官中表达，在免疫调节中起着重要的作用[28]，进一步的研究表明褪黑素可以调节树突状细胞、自然杀伤性细胞的活性、嗜中性粒细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞和增加抗原递呈细胞MHCⅡ的表达以及细胞因子IL-1，IL-6，TNF a的表达[29-33]，本研究发现Mel1amRNA表达于免疫器官脾和肝组织上，这与褪黑素及其受体在免疫调节上的作用相符合。因此，褪黑素可能通过其受体在调节免疫器官增强免疫细胞的活性以及增加免疫因子的分泌具有重要作用。

褪黑素是由松果体分泌的然后通过调节下丘脑—垂体—性腺轴，调节繁殖动物的生殖功能，而对于雌性动物主要通过调节卵巢的功能来实现。本研究发现Mel1amRNA和蛋白在鸭卵巢中均存在并且在卵巢中有较高的表达水平。以前的研究表明褪黑素受体在其他物种的卵巢中表达，鼠和人的卵巢中存在Mel1a表达[34-35]，褪黑素受体在牛卵母细胞和胚胎中也均有表达[36-37]。我们以前的研究表明Mel1a在牛卵巢颗粒细胞中存在表达[38]。Chowdhury等[39]在鸟类生殖系统中研究发现褪黑素及其受体可促进颗粒细胞及卵母细胞的发育和成熟，能调节类固醇激素的合成。褪黑素及其受体通过对卵巢功能的调节如卵母细胞的成熟以及激素的分泌和胚胎的发育，进而调控动物的繁殖性能。褪黑素首先通过与其受体结合而发挥生理调控功能，所以本研究通过研究Mel1amRNA和受体蛋白在不同组织的表达分布，为研究褪黑素及其受体的生理功能如调控昼夜节律，抗凋亡、抗应激、增强免疫力、卵母细胞成熟以及胚胎的发育探究提供基础。

[1] FALCóN J， BESSEAU L， SAUZET S， et al. Melatonin and neuroendocrine regulations in fish [J].JournalDeLaSociétéDeBiologie， 2007， 201(1)：21-29.

[2] RENUKA K， JOSHI B N. Melatonin-induced changes in ovarian function in the freshwater fishChannapunctatus(Bloch) held in long daysand continuous light[J].GeneralandComparativeEndocrinology， 2010， 165(1):42-46.

[3] TAKAYOSHI U， BENTLEY G E， KAZUYOSHI T. Neuroendocrine regulation of gonadotropin secretion in seasonally breeding birds[J].FrontiersinNeuroscience， 2013， 7(7): 38.

[4] REPPART S M， WEAVER D R， GODSON C. Melatonin receptors step into the light: cloning and classification of subtypes[J].InternationalJournalforResearchinVocationalEducationandTraining， 1996， 17(3):100-102.

[5] GARNEVALI O， GIOACCHINI G， MARADONNA F， et al. Melatonin induces follicle maturation in Danio rerio[J].PLoSOne， 2011， 6(5): e19978.

[6] YADAV S K， HALDAR C. Reciprocal interaction between melatonin receptors (Mel(1a)， Mel(1b)， and Mel(1c)) and androgen receptor(AR) expression in immunoregulation of a seasonally breeding bird， Perdicula asiatica: role of photoperiod[J].JournalofPhotochemistryandPhotobiologyBBiology， 2013， 122(9):52-60.

[7] DUBOCOVICH M L， SUGDEND， CARDINALI D P， et al. International union of basic and clinical pharmacology. LXXV. Nomenclature， classification， and pharmacology of G protein-coupled melatonin receptors [J].PharmacologicalReviews， 2010， 62(3):343-380.

[8] SLOMINSKI R M， REITER R J， SCHLABRITZ-LOUTSEVITCH N， et al. Melatonin membrane receptors in peripheraltissues: distribution and functions[J].MolecularandCellularEndocrinology， 2012， 351(2):152-166.

[9] NOSJEAN O， NICOLAS J P， KLUPSCH F， et al. Comparative pharmacological studies of melatonin receptors: MT1， MT2 and MT3/QR2. Tissue distribution of MT3/QR2[J].BiochemicalPharmacology， 2001， 61(11):1369-1379.

[10] PINTOR J， MARTIN L， PELAEZ T， et al. Involvement of melatonin MT(3) receptors in the regulation of intraocular pressurein rabbits[J].EuropeanJournalofPharmacology， 2001， 416(3):251-254.

[11] SHI L， LI N， BO L， et al. Melatonin and hypothalamic-pituitary-gonadal axis[J].CurrentMedicinalChemistry， 2013， 20(15):2017-2031.

[12] BATAILLER M， MULLIER A， SIDIBE A， et al. Neuroanatomical distribution of the orphan GPR50 receptor in adult sheep and rodent brains[J].JournalofNeuroendocrinology， 2012， 24(5): 798-808.

[13] LEVOYE A， DAM J， AYOUB M A， et al. The orphan GPR50 receptor specifically inhibits MT1 melatonin receptor function through heterodimerization[J].EMBOJournal， 2006， 25(13):3012-3023.

[14] DUBOCOVICH M L. Melatonin receptors: are there multiple subtypes？ [J].TrendsinPharmacologicalSciences， 1995， 16(2):50-56.

[15] NATESAN A K， CASSONE V M. Melatonin receptor mRNA localization and rhythmicity in the retina of the domestic chick，Gallusdomesticus[J].VisualNeuroscience， 2002， 19(3):265-274.

[16] RADA J A， WIECHMANN A F. Melatonin receptors in chick ocular tissues: implications for a role of melatonin in ocular growth regulation[J].InvestigativeOphthalmologyandVisualScience， 2006， 47(1): 25-33.

[17] SALLINEN P， SAARELA S， ILVES M， et al. The expression of MT1 and MT2 melatonin receptor mRNA in several rat tissues[J]. Life Sciences， 2005， 76(10):1123-1134.

[18] REPPERT S M， WEAVER D R， EBISAWA T. Cloning and characterization of a mammalian melatonin receptor that mediates reproductive and circadian responses[J].Neuron， 1994， 13(5):1177-1185.

[19] PARK Y J， PARK J G， KIM S J， et al. Melatonin receptor of a reef fish with lunar-related rhythmicity: cloning and daily variations[J].JournalofPinealResearch， 2006， 41(2):166-174.

[20] PARK Y J， PARK J G， HIYAKAWA N， et al. Diurnal and circadian regulation of a melatonin receptor， MT1， in the golden rabbitfish，Siganusguttatus[J].General&ComparativeEndocrinology， 2007， 150(2): 253-262.

[21] PARK Y J， PARK J G， JEONG H B， et al. Expression of the melatonin receptor Mel1c in neural tissues of the reef fishSiganusguttatus[J].ComparativeBiochemistryandPhysiology.PartA，Molecular&IntegrativePhysiology， 2007， 147(1):103-111.

[22] MAZURAISET D， BRIERLEY I， ANGLADE I， et al. Central melatonin receptors in the rainbow trout: comparative distribution of ligand binding and gene expression[J].JournalofComparativeNeurology， 1999， 409(2): 313-324.

[23] IIGO M， KOBAYASHI M， OHTANI-KANEKO， et al. Characteristics， day-night changes， subcellular distribution and localization of melatonin binding sites in the goldfish brain[J].BrainResearch， 1994， 644(2): 213-220.

[24] IIGO M， KEZUKA H， SUZUKI T， et al. Melatonin signal transduction in the goldfish，Carassiusauratus[J].Neuroscience&BiobehavioralReviews，1994， 18(4):563-569.

[25] PANDI-PERUMAL S R， SRINIVASAN V， MAESTRONI G J， et al. Melatonin: nature’s most versatile biological signal？ [J].FEBSJournal， 2006， 273(13): 2813-2838.

[26] KHAN I A， THOMAS P. Melatonin influences gonadotropin II secretion in the Atlantic croaker (Micropogoniasundulatus)[J].General&ComparativeEndocrinology， 1996， 104(2):231-242.

[28] CALVO J R， RAFII-EL-IDRISSI， POZO D， et al. Immunomodulatory role of melatonin: specific binding sites in human and rodent lymphoid cells[J].JournalofPinealResearch， 1995， 18(3): 119-126.

[29] LISSONI P. The pineal gland as a central regulator of cytokine network[J].NeuroEndocrinologyLetters， 1999， 20(6):343-349.

[30] GARCIA-MAURINO S， POZO D， CARRILLO-VICO A， et al. Melatonin activates Th1 lymphocytes by increasing IL-12 production[J].LifeSciences， 1999， 65(20): 2143-2150.

[31] PENA C， RINCON J， PEDREANEZ A， et al. Chemotactic effect of melatonin on leukocytes[J].JournalofPinealResearch， 2007， 43(3):263-269.

[32] BARJAVEL M J， MAMDOUH Z， RAGHBATE N， et al. Differential expression of the melatonin receptor in human monocytes[J].JournalofImmunology， 1998， 160(30):1191-1197.

[33] GUERRERO J M， REITER R J. Melatonin-immune system relationships[J].CurrentTopicsinMedicinalChemistry， 2002， 2(2):167-179.

[34] CLEMENS J W， JARZYNKA M J， WITT-ENDERBY P A. Down-regulation of mt1melatonin receptors in rat ovary following estrogen exposure[J].LifeSciences， 2001， 69(10):27-35.

[35] YIE S M， BROWN G M， LIU G Y. Melatonin and steroids in human preovulatory follicular fluid: seasonal variations and granulose cell steroid production[J].HumanReproduction， 1995， 10(1):50-55.

[36] TIAN X， WANG F， HE C， et al. Beneficial effects of melatonin on bovine oocytes maturation: a mechanistic approach[J].JournalofPinealResearch， 2014， 57(3):239-247.

[37] WANG F， TIAN X， ZHANG L， et al. Beneficial effects of melatonin on in vitro bovine embryonic development are mediated by melatonin receptor[J].JournalofPinealResearch， 2014， 56(3):333-342.

[38] WANG S J， LIU W J， WU C J， et al. Melatonin suppresses apoptosis and stimulates progesterone production by bovine granulosa cells via its receptors (MT1 and MT2)[J].Theriogenology， 2012， 78(7):1517-1526.

[39] CHOWDHURY V S， UBUKA T， TSUTSUI K. Review: melatonin stimu-lates the synthesis and release of gonadotropin-inhibitory hormonein birds[J].General&ComparativeEndocrinology， 2013， 181(1):175-178.

(责任编辑 张 韵)

Study on expression of melatonin receptor Mel1a in several duck tissues

WANG Shu-juan1， LIU Wen-ju1， LIU Xiao-li2， WANG Li-ke1， PANG Xun-sheng1

(1.CollegeofAnimalScience，AnhuiScienceandTechnologyUniversity，Fengyang233100，China; 2.CollegeofAnimalScience，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China)

Melatonin is an indole hormone secreted by the pineal gland， and involved in regulating the circadian， seasonal reproduction， antioxidant activity and anti-apoptosis. The present study investigated the expression， distribution and relative expression quantity ofMel1amRNA and Mel1a protein in different organs of duck， which laid the foundation for further study on regulating effect of melatonin on the reproductive physiology and other biological function. In this study， we collected the heart， spleen， brain， cerebellum， kidney， liver， lung， ovary， pancreas and muscle tissues of duck. The expression of Mel1a in duck tissues were detected by the methods of PCR and immunohistochemical techniques at mRNA and protein levels. TheMel1amRNA relative expression quantities in different organs were detected by real-time PCR. The major results were described as follows:Mel1amRNA was expressed in the heart， spleen， brain， cerebellum， kidney， liver， lung， ovary， pancreas and muscle tissues of duck. Mel1a protein was expressed in the brain， lung， liver， muscle， kidney， heart and pancreas tissues of duck. Moreover， real-time quantitative PCR was used to detect the relative expression level ofMel1agene in different tissues and the gene expression level in brain was selected as a baseline. The quantitative results showed thatMel1agene had high expression levels in brain， lung， ovary， spleen， cerebellum and pancreas and low levels in kidney， liver， muscle and heart. Melatonin plays an important role in physiological regulation function by binding to its receptors and it is very important to study the melatonin receptor expression and distribution， which are useful to elucidate the role and mechanism of melatonin on circadian rhythm， anti-apoptosis， antioxidant activity， enhancing immunity， oocyte maturation and embryo development.

duck; Mel1a; immunohistochemistry; tissue expression; fluorescent quantitative PCR

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.05

2016-02-18

国家自然科学基金项目(31301972)；安徽省自然科学基金项目(1308085QC66)；安徽省教育厅自然科学基金项目(kj20136077)

王淑娟(1983—)，女，山东菏泽人，博士，讲师，从事动物生殖生理与繁殖研究。E-mail：wangshujuan2012@hotmail.com

S834

A

1004-1524(2016)06-0928-07

王淑娟，刘文举，刘晓丽，等. 褪黑素受体Mel1a在鸭不同组织中的表达研究[J].浙江农业学报，2016，28(6)： 928-934.