基于HPLC指纹图谱对牛樟芝质量评价研究

周春权+庞文生+胡娟

【摘 要】目的：建立牛樟芝子实体HPLC指纹图谱，使用中药指纹图谱相似度软件进行分析，比较椴木上生长的菌丝体、液态和固态发酵技术产生的牛樟芝指纹图谱相似度差异性，对不同方法生产的牛樟芝质量进行评价。方法：采用岛津LC-20AT高效液相色谱仪配备SPD-20AV检测器，大连依利特C18色谱柱，流速为1mL/min，流动相为乙腈-0.2%冰乙酸水溶液二元梯度洗脱，检测波长252nm，测定牛樟芝子实体HPLC指纹图谱。结果：在上述条件下，三种培养方法产生的牛樟芝HPLC指纹图谱相似度为0.787，其质量具有一定的稳定性和一致性。结论：通过比较牛樟芝指纹图谱差异性，可以评价其质量。

【关键词】牛樟芝；HPLC指纹图谱；质量评价

【中图分类号】R282.71 【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2016）15-0028-02

牛樟芝亦名牛樟菇、樟生薄孔菌、樟窟内菇、红樟芝，寄生于台湾特有的保育类树种牛樟树，通常腐生于牛樟树上百年的树干空洞内[1]。研究表明，樟芝含有丰富的生理活性物质，包括多糖体、三萜类化合物、超氧化物歧化酶、腺苷、小分子蛋白质等，其中最主要的活性成分是多糖和三萜类化合物[2]。牛樟芝有抗肿瘤、抗病毒、抗过敏、降血脂、降血糖等作用，被台湾人视为“神菌”，价格日涨，一度高过冬虫夏草[3]。

牛樟芝生长极为缓慢，自然产量稀少。为了满足市场的需求，一些商家建立了液态和固态发酵技术以缩短时间和增加牛樟芝产量[4]。也有一些人在其它树木如香樟、沉水樟、甚至杉木上培育“樟芝”，造成牛樟芝产品质量混乱。本项目建立牛樟芝子实体HPLC指纹图谱，分别对三批次牛樟椴木、液态和固态发酵技术产生的“牛樟芝”HPLC指纹图谱共有模式进行比较，以进行质量评价。

1 仪器与材料

1.1 仪器 日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪配备SPD-20AV检测器。

1.2 材料 牛樟椴木、液态和固态发酵技术生产牛樟芝的干燥子实体。乙腈（德国Merck公司）为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 供试品制备 牛樟芝供试品，5倍量体积无水乙醇浸泡30min后，水浴回流提取2次，每次2h。合并两次提取滤液后减压浓缩至近干，真空减压干燥得干浸膏粉。精密称取牛樟芝乙醇干膏粉1g，用色谱甲醇超声溶解，定容于5mL容量瓶中，所得牛樟芝质量浓度为0.25g/mL。过0.45μm滤膜，备用。

2.2 色谱条件 采用乙腈-0.2%的醋酸溶液进行梯度洗脱，检测波长为252nm，流速为1mL/min，室温，进样量10μL，梯度洗脱程序见表1。

2.3 相似度计算 选择具有代表性的牛樟椴木、液态和固态发酵技术生产牛樟芝的干燥子实体样品各3个批次，通过实验获取样本图谱（即指纹图谱）并进行共有峰的提取，然后根据对共有峰进行均值或中位数计算的结果建立样品的对照指纹图谱；再将各样品的对照指纹图谱进行保留时间、色谱峰匹配，最后采用相似度评价系统软件自动计算相似度，采用双定性、双定量、相似度等参数作为其质量评价的信息参数。

3 结果

3.1 提取条件的优化与确定 在文献[5]的基础上，采用无水乙醇对牛樟芝的三萜类成分的提取效果较好；对比加热回流和超声处理提取牛樟芝三萜的效果，发现加热回流的提取效果较佳；加热回流2次、每次2h，提取效果较好。

3.2 色谱条件的优化与确定

3.2.1 检测波长的选择 采用对245、250、252、260nm 4个波长下的特征峰数目及峰面积进行比较，其中252nm波长下牛樟芝的三萜类成分具有最大吸收，特征峰数目较多、峰面积较大，且基线平稳，最终确定选择252nm作为指纹图谱的检测波长。

3.2.2 梯度洗脱条件的确定 试验采用乙腈-磷酸溶液、乙腈-冰醋酸溶液，调节不同的酸浓度进行梯度洗脱，其中乙腈-0.2%冰醋酸系统的洗脱效果较佳。

3.3 指纹图谱的建立与分析 牛樟椴木牛樟芝3批，液态发酵牛樟芝3批，固态发酵牛樟芝3批；通过对不同类型样品的指纹图谱进行比较，采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A版）生成共有模式。三种类型的牛樟芝HPLC指纹图谱共有模式叠加图见图1。

通过中药指纹图谱相似度软件得出牛樟芝HPLC指纹图谱共有模式并与共有模式比较得出的相似度，三种培养方法产生的牛樟芝相似度为0.787；所建立的方法不仅分离度较好，且标示出了7个主要的特征峰，三种培养方法产生的牛樟芝出峰均很明显。结果表明，牛樟椴木培养、液态发酵、固态发酵牛樟芝指纹图谱相似度较好，其质量具有一定的稳定性和一致性。

4 讨论

因牛樟芝具有解毒保肝、抗癌、提高免疫、抗过敏、降血脂等神奇功效，素有“药芝之王”、“台湾森林中之红宝石”的美誉。由于野生牛樟芝在民间的应用广泛，加之野生原料资源匮乏，其价格不断高涨，并且激发了研究机构、生物公司的强烈兴趣。

目前，牛樟芝人工培育大致可以分为椴木栽培法、固体培养法、液体发酵法三种。椴木栽培法利用樟芝原有宿主牛樟树椴木为培养基栽培牛樟芝，能获得与野生牛樟芝相同之成分，功效相同，避免野生牛樟树被盗伐，但培养时间长达二至三年，培养成本高。固体培养法将牛樟芝菌种以太空包进行菌丝体培养，太空包含有纤维物、醣类、五谷杂粮类等，培养时间约三个月，培养成本稍高。液体发酵法，利用液体发酵槽进行菌种液体发酵以收取菌丝体，培养时间短，约7～14d左右，培养成本较低。

本文对不同的人工培育法生产樟芝的HPLC化学指纹图谱比较表明，随着现代生物技术的不断发展，不同人工方法培育的牛樟芝成份组成一致性在不断提高，有利于牛樟树资源的保护，同时满足人们对牛樟芝健康产品的需求。

参考文献

[1]陈体强， 李开本，林章余.台湾食（药）用菌发展现状[J]. 福建农业科技，2000（1）： 20-21.

[2]Chang TunTschu，Wang WuRong，Chou ChengJen. Differentiation of mycelia and basidiomes of Antrodia cinnamomea using certain chemical components[J]. Taiwan Journal of Forest Science 2011， 26（2）： 125-133.

[3]Chenhsien Lee， Kenghao Hsu， Shengyang Wang.Cloning and Characterization of the Lanosterol 14α-Demethylase Gene from Antrodia cinnamomea[J]. J. Agric. Food Chem. 2010， 58（12）：4800-4807.

[4]TunTschu Chang，Wurong Wang. Basidiomatal formation of Antrodia cinnamomea on artificial agar media[J]. Bot. Bull. Acad. Sin. 2005， 46（1）：151-154.

[5]孙金旭.樟芝真菌萜类物质提取研究及色谱指纹图谱的建立[J].中国酿造， 2011（11）：135-138.

（编辑：熊金富）