盲肠结扎穿孔术法建立的脓毒症大鼠动物模型不同脏器组织超微结构动态变化观察

胡丹丹，杨国良，楼黎明

盲肠结扎穿孔术法建立的脓毒症大鼠动物模型不同脏器组织超微结构动态变化观察

胡丹丹，杨国良，楼黎明

目的观察盲肠结扎穿孔术法（CLP）建立的脓毒症大鼠动物模型心、肝、肾不同脏器组织超微结构的动态变化。方法雄性SD大鼠32只，随机分为正常组、假手术组、模型6h组和模型24 h组，各8只。CLP建立脓毒症大鼠动物模型，观察各组大鼠心肌酶谱、肝肾功能的变化，同时通过透射电镜观察各组大鼠心肌细胞、肝细胞及肾小球超微结构改变。结果CLP术后6 h，模型组大鼠心肌细胞线粒体肿胀，部分肌纤维稀疏；肝细胞溶解，内质网减少，线粒体肿胀；肾小球结构未见明显改变。至术后24 h，大部分心肌细胞出现自溶，偶见心肌细胞呈核固缩、核碎裂等坏死改变；肝细胞线粒体与内质网广泛的空泡变性，细胞器模糊结构不清；肾小球基底膜部分增厚，部分足突细胞融合消失，肾小球塌陷等。结论脓毒症大鼠早期就存在心、肝等多脏器损伤，肾损伤出现较晚。

盲肠结扎穿孔；脓毒症；多脏器损伤

[Modern PracticalMedicine,2016,28(10):1271-1273]

脓毒症具有发生率高、病死率高及治疗费用高等特点，可导致多器官功能受损，包括急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、急性肾功能衰竭（ARF）、急性心力衰竭（AHF）、急性肝损伤、凝血功能紊乱、骨髓功能抑制、脑损伤以及酸碱平衡紊乱等，进而出现多器官功能障碍综合征（MODS）。脓毒症与其并发症是重症监护室患者首要的死因，占10%～50%[1-2]。本文以盲肠结扎穿孔术（CLP）法制备脓毒症大鼠动物模型，通过动态观察大鼠心、肝、肾等重要脏器超微结构的变化，以期探讨脓毒症脏器损伤的时间。报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物雄性SD大鼠32只，清洁级，体质量（200±20）g，由浙江中医药大学实验动物中心提供和饲养，许可证号：SYXK（浙）2013-0184。大鼠造模前在标准饲养条件下适应性喂养1周，术前24h禁食禁水。

1.2 主要仪器及试剂低温离心机（Eppendorf Centrifuge 5804，德国）；Vortex-Genie 2旋涡混合器（SI美国）；AY220精密天平（SHIMADZU日本岛津）；自动生化分析仪。2%戊巴比妥钠（上海西塘生物科技有限公司），PBS原液。

1.3 方法

1.3.1 脓毒症模型的制备采用CLP法建立脓毒症大鼠动物模型[3]，100g/L水合氯醛按300mg/kg腹腔注射麻醉后固定，沿腹中线作2.0 cm切口，打开腹腔后小心分离盲肠，避免碰触肠系膜血管，在盲肠根部结扎，在与肠系膜相对的盲端肠壁浆膜面用9号针头穿刺2次，轻挤出少量内容物，还纳盲肠于腹腔，关闭腹腔，逐层缝合，术后即刻予以皮下注射0.9%

氯化钠注射液10m l/kg补充手术过程中丢失的体液。

1.3.2 分组及给药将32只雄性SD大鼠分为正常组、假手术组、模型6h组和模型24h组，各8只。模型6 h组与模型24 h组行CLP术；假手术组麻醉后开腹翻动肠道，关腹；正常组与其余各组同步饲养。模型6 h组于CLP术后6 h麻醉，腹主动脉采血处死，其余各组于CLP术后24h麻醉，腹主动脉采血处死。

1.4 指标检测

1.4.1 生化指标检测各组术后检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、肌酸激酶（CK）及肌酸激酶同工酶（CK-MB），送检浙江中医药大学附属第三医院检验科，使用自动生化分析仪测定。

1.4.2 心、肝、肾脏器组织透射电镜样品制备及观察迅速切取1mm3大小的心肌、左肾肾门及肝左叶组织块，保持低温环境下2.5%戊二醛固定液固定2h以上，0.1M磷酸缓冲液充分洗涤；1%锇酸后固定1.5 h，磷酸缓冲液清洗0.5 h；梯度酒精脱水；浸透；包埋。制作好包埋块后，用超薄切片制刀机分割玻璃条，制成玻璃刀，并用橡皮膏制作水槽。然后在超薄切片机上进行超薄切片。首先1m半薄切片，天青蓝染色，在光镜下观察定位，超薄切片，厚度80 nm，捞取切片在事先已做好支持膜的铜网上。超薄切片制作好后，柠檬酸铅染色液染色12min，蒸馏水清洗三次后，自然晾干，透射电子显微镜下观察。

1.5 统计方法数据采用SPSS 20.0软件处理，计量资料以均数±标准差表示，采用F或q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生化指标变化比较各组生化指标差异均有统计学意义（≥5.69，均＜0.05），术后模型6 h及模型24 h ALT、AST、Cr、BUN、CK及CK-MB与假手术组比较，差异均有统计学意义（≥3.48，均＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠生化指标动态变化比较

2.2 各组不同脏器超微结构动态变化心肌超微结构：正常组及假手术组大鼠心肌细胞内肌丝、肌节结构清晰，排列整齐，线粒体排列整齐，肌原纤维结构正常。CLP术后6 h，心肌细胞线粒体肿胀，部分肌纤维稀疏。CLP术后24h，心肌细胞线粒体肿胀加重，部分空泡变性，大部分心肌细胞出现自溶，偶见心肌细胞呈核固缩、核碎裂、胞浆崩解等坏死改变。见封二彩图3。

肝细胞超微结构：正常组及假手术组大鼠肝细胞形态规则，细胞浆中有丰富的线粒体、粗面内质网，线粒体嵴正常而清晰，细胞核清晰可见。CLP术后6 h，肝细胞内质网减少，线粒体肿胀，偶见肝细胞溶解。CLP术后24h，肝细胞胞浆出现部分溶解，线粒体与内质网广泛的空泡变性，细胞器模糊结构不清，部分肝细胞可见核染色质固缩。见封二彩图4。

肾小球超微结构：正常组及假手术组大鼠肾小球结构正常，基底膜完整，上皮细胞足突清晰，近曲小管和远曲小管结构均正常，细胞连接清楚，绒毛存在，细胞器完整。CLP术后6h，超微结构未见明显改变，偶见部分足突细胞变平。CLP术后24h，肾小球基底膜部分增厚，部分足突细胞融合消失；肾小球塌陷。见封二彩图5。

3 讨论

脓毒症动物模型复制方法可分为细菌或内毒素攻击模型和局部感染模型两大类。内毒素攻击模型可控性比较强，动物的反应性相对来说比较一致，但费用高。CLP模型属局部感染造模方法，其原理是模拟人类阑尾炎或憩室炎穿孔的病例造成混合性细菌感染，坏死组织可成为炎症反应来源，CLP模型在距离原发打击一定时间后，各器官的生化指标均出现不同程度的异常改变，并伴有全身血流动力学改变和凝血系统功能异常，而细胞因子水平升高相对平缓，持续时间长[4]。这些特点与临床患者实际情况相近，在局部感染模型上进行的抗炎药物试验取得的结果也与临床相似。因此是目前公认的临床相关性较强的脓毒症动物模型。

众所周知，脓毒症可导致多器官损伤。脓毒症合并心肌损伤是ICU非心源性死亡的主要原因，也是脓毒症的常见并发症。有数据表明，脓毒症患者40%～50%可发生心肌抑制[5]，7%可发生心力衰竭[6]，其机制可能与炎症因子对心肌的损伤[7]，心肌细胞钙离子超载[8]，氧自由基损伤[9]，能量代谢障碍[10]等相关。肾脏血流量非常丰富，也是脓毒症病程中受研究者重视的重要器官之一。脓毒症、重度脓毒症以及脓毒症休克患者并伴发急性肾损伤(AKI)的概率逐渐增加，依次约为19%、23%和51%，若进展为急性肾功能衰竭(ARF)，病死率可高达70%左右[11-12]，倘若能早发现、早干预，就能显著降低脓毒症患者的病死率[13]。肝脏不仅是脓毒症中最易受损的器官之一，还对脓毒症的发生、发展有举足轻重的作用，其结构、功能和代谢的变化影响着脓毒症病情的发展。急性肝损伤可发生在脓毒症的任何阶段。早期肝功能障碍是脓毒症死亡的一项独立而实际的预警因素，超过传统的循环、肾脏、中枢神经系统等死亡预警因素[14]。其发生机制与肝微循环与肝血流改变导致肝细胞缺血缺氧，肝细胞的能量代谢障碍，内毒素直接对库普弗细胞的损伤作用等相关[15]。而对于心、肝、肾等脏器损伤在脓毒症病程中出现的时间点鲜有报道。

本实验中生化指标检测提示：CLP术后6h，CKMB、CK、ALT、AST、BUN均出现不同程度的升高，与假手术组差异均有统计学意义（均P＜0.05）。至CLP术后24h，各项指标均显著高于假手术组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），提示CLP大鼠早期即存在心肌损伤及肝功能损害，肾功能损伤不明显，后期则多脏器功能受累。超微结构显示表明，脓毒症大鼠早期即存在心、肝等多脏器功能损伤，肾损伤出现较晚，随着时间的延长，心、肝、肾等多脏器损伤，故脓毒症治疗的早期就应兼顾脏器功能的保护。

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Dynamicalchangesofultrastructuralorgans in septic ratmodelestablished by cecal ligation and perforation

HUDandan,YANGGuoliang,LOU Liming.(The Third A ffiliated Hospitalof Zhejiang TraditionalChineseMedicalUniversity,Hangzhou 310005,Zhejiang,China)

Objective To obersvedynamicalchangesofultrastructureofmajororgansin septic ratmodelestablished by cecal ligation and perforation(CLP),including heart,liverand kidney.Methods Thirty-twomale SD ratswere random ly divided into fourgroups:normalgroup,sham-operated group,6-hourmodelgroup and 24-hourmodelgroup.Therewereeightratsineachgroup.Thechangesofmyocardialenzymes,liverand kidney functionwereobserved. The ultrastructural changes ofmyocardial cells,hepatocytes and glomeruliwere observed by transm ission electron microscope.Results Six hoursafterCLP,them itochondriawereswollen and somemuscle fibersweresparse in the modelgroup;atthesame time,the livercelldissolved,them itochondrion of livercellgotswelling,and theendoplasmic reticulum of liver celldecreased;but theglomerularstructure did notchangeobviously.Twenty-fourhoursafter CLP,mostof the cardiomyocytes showed autolysis,and occasionally necrotic changessuch asnuclear pyknosisand nuclear fragmentationwereobserved.Thevacuolardegeneration ofmitochondriaand endoplasmic reticulumin liver cellsand theunclearstructureoforganelleswereunclear.Thebasilarmembraneof renalglomerulus partly gotthick, and footprocesscell fused and disappeared.Conclusions Rats with sepsishad earlymultipleorgan injury,including heartand liver,while kidneywasdamaged later.

Cecal ligation and perforation；Sepsis；Multiple organ injury

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.10.004

R574.61；R632.5

A

1671-0800(2016)10-1271-03

2016-03-14

（本文编辑：钟美春）

浙江省自然科学基金（LY12H15004，LQ12H27006）；浙江省中医药科技计划（2012ZB069）；浙江中医药大学附属第三医院重点项目（ZS10ZA04）

310005杭州，浙江中医药大学附属第三医院（胡丹丹、楼黎明）；浙江省中西医结合医院（杨国良）

楼黎明，Email：llm2348@163.com