未发育成熟颅骨缺损后不同时期骨痂组织中骨桥蛋白的表达变化

李鲁 张春阳 崔阳 (包头医学院; 包头医学院第一附属医院神经外科, 内蒙古 包头 04000)

未发育成熟颅骨缺损后不同时期骨痂组织中骨桥蛋白的表达变化

李鲁1张春阳2*崔阳1
(1包头医学院;2包头医学院第一附属医院神经外科, 内蒙古 包头 014000)

颅骨缺损; 骨桥蛋白

骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种分泌型酸化糖蛋白，带负电荷，具有亲水性，富含唾液酸。人的OPN基因由7个外显子和6个内含子组成，定位于4q13上[1]。不同物种的OPN具有不同的结构序列，但是不同物种的OPN均含有相同的高度保守序列，该序列是促进细胞粘附的蛋白质中的特有结构。OPN是重要的细胞外基质蛋白，也是重要的细胞因子，在介导细胞扩散、转移，与基质间的黏附、骨组织矿化和重建、血管形成、抑制凋亡、免疫调节、信号转导等过程中发挥着重要作用[2]。在未发育成熟颅骨缺损的愈合过程中，骨桥蛋白可能通过促进骨基质的形成而促进颅骨缺损的愈合。本实验通过研究以未发育成熟山羊(3个月龄)为研究对象，通过实时定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, q-RT-PCR)方法观察骨桥蛋白信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid, mRNA)在颅骨缺损创缘愈合的不同时期基因表达情况，进而寻找骨桥蛋白在未发育成熟颅骨缺损愈合过程中发挥重要作用的证据，为进一步研究骨桥蛋白促进未发育成熟颅骨缺损愈合的作用机制打下基础。

一、材料与方法

1.动物模型的建立：3个月龄的母山羊12只，体重(24.6±2.1)kg ，随机分实验组与对照组，各组6只。实验组头顶部皮肤脱毛，安尔碘消毒3遍。2%利多卡因5 ml头皮局部浸润麻醉。取中线向左侧旁2 cm直切口，切口长约5 cm。依次切开皮肤、皮下组织、骨膜，严密止血，钝性推开骨膜。骨钻钻孔，并扩大骨窗至3 cm×3 cm，保留硬脑膜完整(图1)。生理盐水冲洗术腔至冲洗水清亮。逐层缝合皮下组织、皮肤，包扎固定。对照组颅骨不予特殊处理。分别于术后3 d、7 d、14 d、21 d、30 d对实验组与对照组颅骨取材。

2.组织处理：脱毛、消毒。切口头皮。实验组：咬骨钳咬取骨缘新生骨痂组织。对照组：咬骨钳咬取相同部位颅骨组织。每次咬取骨痂部位无重复。所得骨痂组织、骨组织液氮中保存。

3.提取实验组骨痂组织与对照组骨组织总核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)：取出保存的骨痂组织、骨组织，称重。置于液氮预冷后的研钵中研磨成粉末状。收集骨粉于离心管中，加入1 ml Trizol，摇晃振荡2 min，室温静置5 min。加入氯仿200 μl，摇晃振荡1 min，静置5 min。4℃、12 000 r/min，离心15 min。经离心管中上层水相移至另一离心管中，加入异丙醇0.5 ml。室温静置10 min。4℃、12 000 r/min，离心10 min。弃上清，加入75%的乙醇1 ml，振荡混匀，20℃静置15 min。4℃、7 500 r/min，离心5 min，弃上清。自然干燥RNA沉淀30 min。加入200 μl焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate, DEPC)水溶解RNA沉淀，振荡混匀，65℃加热15 min。所得RNA保存于-20℃冰箱。

4.RNA浓度及纯度测定：分别取骨痂组织、骨组织RNA样品2 μl，加入98 μl体积分数0.1%DEPC水，稀释50倍后用紫外分光光度计测量其浓度、A260/A280 值、A260/A230 值。

5.逆转录生成单链脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)：依据第一链cDNA合成试剂盒(美国赛默飞)操作，依次加入：总RNA 3.024 μg、多聚胸腺嘧啶T重复寡核苷酸2 μl、脱氧核糖核苷三磷酸(2.5 mM) 2 μl，加入无酶水至14.5 μl，混匀后冰上静置5 min，依次加入5×反转录缓冲液4 μl、核糖核酸酶抑制剂0.5 μl、莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶1 μl，加入无酶水至20 μl。42℃、60 min，90℃、5 min终止反应。

6.q-RT-PCR：依据q-RT-PCR试剂盒(美国赛默飞)操作。配制 20 μl q-RT-PCR反应体系：2×浓缩的聚合酶链式反应扩增预混液l0 μl，正向引物l ul，反向引物l ul，模板脱氧核糖核酸100 ng，无酶水加至20l μl。q-RT-PCR反应程序：95℃预变性l0 min；95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。

7.统计分析：各时间点颅骨标本q-RT-PCR重复3次，每时间点每组3个样本。应用2-ΔΔCt法对q-RT-PCR数据进行转换。所有数据均采用SPSS 19.0统计软件进行分析，采用双因素方差分析，P<0.05认为有统计学意义。利用GraphPad Prism 5绘制图表(图2)。

图1 山羊颅骨缺损模型，大小约3 cm×3 cm(箭头所示)

图2 不同时间点实验组与对照组OPN mRNA表达水平比较

aP<0.001,vs对照组3 d及7 d;bP<0.05,vs对照组 7 d;cP<0.001,vs对照组7 d

Note: C: 对照组; T: 实验组

二、结果

山羊颅骨缺损形成14 d后OPN在创缘新生骨痂组织中的mRNA表达高于正常骨组织(图2,aP<0.001)。颅骨缺损形成后14 d时创缘处新生骨痂组织内OPN mRNA表达明显高于7 d时(图2,bP<0.05)，至21 d时达最高峰(图2,aP<0.001)，30 d时OPN mRNA的表达较前有所下降，但仍维持在较高水平(图2,aP<0.001)。

三、讨论

OPN是一种骨特异性的分泌型蛋白，带有负电荷，在各种组织中均有表达，生理情况下，主要表达于骨和上皮细胞表面[3]。在成骨细胞的增值、分化和骨的重建及矿化过程中发挥重要作用。颅盖骨主要为膜形成骨。有原位杂交和免疫组化实验表明，OPN在鼠颅盖骨中代表骨形成活动活跃的骨外膜立方形成骨细胞中有表达，并且在代表骨重建活跃的骨内膜扁平形成骨细胞中也有表达[4]。在骨折愈合过程中，表达OPN的成骨细胞逐渐增多，骨桥蛋白的表达与成骨细胞成熟程度相一致[5]。研究发现，敲除OPN基因的小鼠骨抵抗损伤的能力明显下降[6]。不仅如此OPN在骨折的矿化过程中仍发挥重要作用。OPN含有的RGD序列和多元氨基酸结构域被认为与羟基磷灰石的晶核化有关[7]。在体外实验表明OPN磷酸化后可抑制羟基磷灰石晶体形成[8]，而体内的实验表明OPN在骨基质的矿化过程中，主要通过影响骨基质的矿化的速率实现，而并不影响羟基磷灰石的结晶生长成核[9]。本实验通过对山羊颅骨缺损不同时期颅骨创缘骨痂组织OPN的表达变化研究，证实了在颅骨创缘愈合期，创缘新生骨痂组织中OPN的表达高于正常骨组织。证实OPN参与了颅骨缺损的自身修复过程，而对于其作用机理仍需要进一步研究。明确OPN在颅骨缺损创缘骨形成过程中的作用，探明这一过程中OPN的作用机制，有助于丰富神经外科临床中颅骨缺损修复的理论，为解决儿童颅骨缺损的修复提供更多的途径。

1茅文斌, 邵增务. 骨桥蛋白与骨质疏松症研究进展 [J]. 中国骨质疏松杂志, 2007, 13(3): 204-207.

3Yokosaki Y, Higashikawa F. Osteopontin receptors and signal transduction [J]. Nihon Rinsho, 2005, 63 (Suppl 10): 613-617.

4Yokosaki Y, Tanaka K, Higashikawa F, et al. Distinct structural requirements for binding of the integrins alphavbeta6, alphavbeta3, alphavbeta5, alpha5beta1 and alpha9beta1 to osteopontin [J]. Matrix Biol, 2005, 24(6): 418-427.

5张伟国, 王英. 鼠颅面部矿化组织发育中非胶原蛋白的表达 [J]. 口腔颌面外科杂志, 1998, 8(3): 190-194.

6Thurner PJ, Chen CG, Ionova-Martin S, et al. Osteopontin de-ficiency increases bone fragility but preserves bone mass [J]. Bone, 2010, 46(6): 1564-1573.

7Zhang B, Sun Y, Chen L, et al. Expression and distribution of SIBLING proteins in the predentin/dentin and mandible of hyp mice [J]. Oral Dis, 2010, 16(5): 453-464.

8Huang W, Carlsen B, Rudkin G, et al. Osteopontin is a negative regulator of proliferation and differentiation in MC3T3-E1 pre-osteoblastic cells [J]. Bone, 2004, 34(5): 799-808.

9Chiang TI, Chang IC, Lee HS, et al. Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment [J]. Osteoporos Int, 2011, 22(2): 577-585.

1671-2897(2016)15-171-02

·简报·

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李鲁，硕士研究生，主治医师，E-mail: swdalu@163.com

*通讯作者：张春阳，教授、主任医师，硕士生导师，E-mail: 445843578@qq.com

10.7666/d.y1709707.

2015-11-03；

2015-12-26)