拟南芥Patellin 2相互作用蛋白的筛选及鉴定

李 琼，王学路，2，苏 伟

(1. 复旦大学 生命科学学院 植物科学研究所，上海 200438；2. 华中农业大学 生命科学技术学院，武汉 430070)



拟南芥Patellin 2相互作用蛋白的筛选及鉴定

李 琼1，王学路1，2，苏 伟1

(1. 复旦大学 生命科学学院 植物科学研究所，上海 200438；2. 华中农业大学 生命科学技术学院，武汉 430070)

Patellin 2(PATL2)蛋白是具有SEC14蛋白结构域的脂质转移蛋白，定位于细胞分裂后期的细胞板上，在细胞分裂过程中发挥重要的作用.同时，PATL2蛋白还受到植物激素和环境变化的调控，说明PATL2可能在植物激素和环境变化的调控下参与细胞分裂过程.为了深入了解PATL2蛋白的生物学功能，研究PATL2蛋白发挥作用的分子生物学机制，我们分析了它在植物体内的表达特点和与之相互作用的蛋白.我们通过免疫共沉淀与液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析了过表达PATL2的转基因植株，并获得了多个可能与PATL2相互作用的蛋白，其中一个是细胞周期蛋白依赖性激酶CDKB2；2.通过观察PATL2启动子驱动的GUS报告基因在植物中的表达，发现PATL2基因在叶片、花瓣、花粉中广泛表达，但在角果中的表达非常有限，仅存在于角果的两端，这与已报道的CDKB2；2的组织分布部分相同.同时，烟草叶表皮细胞瞬时表达结果表明PATL2和CDKB2；2能够共定位于烟草叶表皮细胞的细胞膜和细胞质中.体外pull-down实验和双分子荧光互补实验(BiFC)实验分别确定了PATL2和CDKB2；2在植物体外和植物体内的相互作用.

Patellin 2； CDKB2；2； 蛋白质相互作用

拟南芥Patellins蛋白是一类含有SEC14蛋白结构域的、具有脂质转移活性的蛋白，因定位于分裂细胞的细胞板上而得名[1].拟南芥中共有6个Patellins蛋白，依次命名为Patellin 1(PATL1)～Patellin 6(PATL6).PATLs蛋白具有潜在的转移脂质的能力，可能在生物膜运输等过程中发挥功能[1].拟南芥PATL1蛋白是一个外周膜蛋白，它能够与PtdIns(5)P，PtdIns(4，5)P2和PtdIns(3)P[1]结合.并且，PATL3和PATL6定位于烟草叶表皮细胞的细胞膜，参与植物对病毒的防御[2].

Patellins蛋白家族成员由不保守的N端、SEC14结构域和GOLD结构域(Golgi dynamics domain)3部分构成[1].其中，SEC14结构域在进化上最为保守，广泛存在于植物、酵母、无脊椎动物和哺乳动物中[3].SEC14结构域可以与不同类型的脂类结合并在脂质代谢、生物膜运输等过程中发挥作用[3-8].同时，SEC14结构域也可与其他蛋白结构域组合，形成超家族，仅在拟南芥中就存在31个Sec14p相关蛋白[9-12].GOLD结构域存在于一系列参与高尔基体囊泡运输的蛋白中[13].拟南芥PATLs蛋白是SEC14结构域蛋白家族的重要成员之一.遗传学分析PATLs多突变体表明，PATLs家族成员均参与调控植物胚根原的细胞分裂[14].在胞质分裂过程中，PATL1和PATL2被招募到正在扩张和成熟的细胞板的成膜体上[1，14].PATLs蛋白参与调控植物特有的胞质分裂过程.PATL2蛋白还受到外界环境和激素的调控[15-17]，说明PATL2可能在植物激素和环境变化的调控下参与细胞分裂过程.但是PATL2的调节因子和底物尚不清楚，PATL2在环境和激素信号调控下的细胞分裂过程中的作用机制也不可知.此时，筛选PATL2互作蛋白、探究PATL2在环境和激素信号调节下的细胞分裂过程中的分子生物学功能显得尤为重要.

在真核生物的细胞分裂过程中，细胞周期蛋白(cyclins)是一类依赖细胞分裂周期性特异表达的蛋白质，它们与细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-Dependent Kinases， CDKs)共同调控细胞周期的运行[18-19].细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖性激酶结合并将之激活[18-19].CDKs和细胞周期蛋白都由庞大的基因家族构成，而且它们能够形成种类繁多的复合体，不同的复合体在细胞分裂的不同时期和不同位置发挥不同的功能，确保细胞分裂的正常进行[18-19].CDKs与细胞周期蛋白复合体作用的底物包括转录调节因子、细胞骨架、核基质、核膜蛋白等一系列细胞分裂相关蛋白[18-19].

植物CDKs被分为7类[20-22]，从CDKA到CDKG.其中，CDKA家族成员最多，它含有PSTAIRE基序，与酵母Sc；CDC28、Sc；CDC2和人类CDK1、CDK2、CDK3最相似.CDKA可以互补酵母突变体cdc2/cdc28表型的植物CDKs，它们调控细胞分裂G1/S期和G2/M期[19].CDKC和CDKE的成员很少、分别含有PITAIRE基序和SPTAIRE基序，能够磷酸化RNA聚合酶Ⅱ的C端，进而调控转录[19，23].CDKD和CDKF是植物的CAK(CDK-activating kinases)，具有磷酸化并激活CDK的酶活性[24-26].CDKG参与调节花粉细胞壁胼胝质体的合成和雄性减数分裂[22，27].CDKB是一类植物特有的CDK，被分为两个亚类：CDKB1和CDKB2.拟南芥中这两个亚类分别包含两个基因：CDKB1；1和CDKB1；2、CDKB2；1和CDKB2；2.它们的转录严格依赖细胞分裂，仅在细胞分裂的G2/M期转录[19-20，28-29].其中，CDKB2；2参与调控茎尖分生组织的细胞分裂[30]，并且在花中呈现一定程度的高丰度表达[30-31].

本研究为了寻找PATL2蛋白的互作蛋白，通过液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)找到PATL2的互作蛋白CDKB2；2.组织化学GUS染色和烟草瞬时表达实验说明了两个蛋白相互作用的生物学基础.双分子荧光互补实验(BiFC)和体外pull-down实验验证了PATL2与CDKB2；2的相互作用，研究结果为深入研究PATLs家族蛋白在细胞分裂过程中的遗传功能奠定了分子基础.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

拟南芥(Arabidopsisthaliana)Col-0和35S∶∶PATL2-FLAG：Col-0.野生烟草Nicotianabenthamiana.大肠杆菌克隆菌株EscherichiacoliDH5α，表达菌株EscherichiacoliTransetta.根瘤农杆菌菌株AgrobacteriumtumefaciensGV3101.植物表达载体pCAMBIA-1302E(pCAMBIA-1302改造，GFP标签)、pCAMBIA-mCherry、pCAMBIA-1306(Flag标签)和pCAMBIA-1391Z(GUS报告基因).烟草瞬时表达载体pXY104(cYFP)、pXY106(nYFP).大肠杆菌表达载体pMAL-c2X(MBP标签)和pET-28a(His-tag).这些材料均由本实验室保存.

植物生长培养基(1/2MS培养基)：2.2g/L MS粉、0.8%琼脂粉、pH5.6～6.0，向其中添加700μL/L潮霉素用于抗性筛选.大肠杆菌和根癌农杆菌完全培养基LB：1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化钠，向其中添加抗生素进行筛选，抗生素浓度分别为：卡那霉素100μg/mL、氨苄青霉素100μg/mL、庆大霉素50μg/mL、利福平25μg/mL，液体培养基中加入1%琼脂粉即配制成相应的固体培养基.限制性内切酶购于TaKaRa或NEB公司.T4DNA连接酶购于TaKaRa公司.

1.2 方法

1.2.1 植物材料和生长条件

将干燥的拟南芥种子用75%酒精表面消毒20min(共两次，每次10min)后，100%酒精超净台消毒并播种于植物生长培养基上.播种的培养基置于4℃冰箱处理3d后，放于拟南芥专用恒温光照培养箱(Percival)内生长，培养条件为23℃、16h光照/8h黑暗.本研究中，用于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的植物材料为在该条件下培养12d的植物幼苗.

人工气候室内23℃、16h光照/8h黑暗条件下将烟草种子播种于土中，生长7d后移苗，单穴单株培养，培养条件不变.

1.2.2 免疫共沉淀和液相色谱-串联质谱

称取3g生长12d的35S∶∶PATL2-FLAG：Col-0幼苗，吸水纸吸干、液氮研磨后，加入2倍等体积植物蛋白提取液和1/100植物蛋白酶抑制剂，震荡混匀，4℃结合1h.然后4℃低温离心获取上清液，并加入预处理的Flag树脂(购于Sigma公司)，再次4℃结合3h.随后洗涤5次.获取的沉淀加入等体积的SDS上样缓冲液，95℃变性10min后，SDS-PAGE电泳.最后切胶送样至复旦大学遗传工程国家重点实验室生物化学平台进行液相色谱-串联质谱分析.

PC机上还可以提供比智能手机丰富的控制功能和更人性化的人机界面，通过Internet访问农产品服务器上的视频信息：一方面可以实时监控农产品长势与营养需求，提供及时决策；另一方面可供农业专家系统对自然灾害防御，农作物病虫害分析，农产品后期可视化溯源提供依据。

1.2.3 组织化学GUS染色

分析拟南芥基因组(www.Arabidopsis.org)获得PATL2基因编码区上游1.5kb启动子序列信息，通过PCR扩增并构建于含有GUS基因的pCAMBIA-1391Z载体上.获得转基因纯合植株后，选取不同时期的植物材料，放入GUS染液中，在37℃黑暗条件下染色2h，逐次用50%酒精、75%酒精和100%酒精脱色至植物材料褪绿.在100%的酒精中保存，用Leica DFC290体视显微镜拍照.

1.2.4 烟草共定位及双分子荧光互补(BiFC)实验

将所构建的植物表达载体PATL2-mCherry、PATL2-GFP、PATL2-cYFP、nYFP-CDKB2；2等转化进入根癌农杆菌GV3101(庆大霉素抗性和利福平抗性).固体培养基在28℃恒温培养箱内生长2d后，挑菌，液体培养基28℃、200r/min过夜扩大培养.用50mL塑料管收集菌液，离心获得菌体沉淀.将菌体沉淀重悬于烟草转化缓冲液中，并调至OD600=1.重悬的根癌农杆菌注射于适龄烟草叶片背面，暗处生长1d、光照条件下生长2d后，用Leica SP8激光共聚焦显微镜观察对应波长的荧光信号.DAPI染色时，将烟草叶片切片置于 2μg/mL 的DAPI工作液中染色30～50min，Leica SP8激光共聚焦显微镜观察 405nm 波长激发光下收到的荧光信号.

1.2.5 重组蛋白的表达及纯化

大肠杆菌表达载体转入E.coliTransetta中，挑菌，37℃过夜培养，然后于37℃、200r/min扩大培养至OD600=1.加入0.4mmol/L IPTG、25℃诱导过夜.收集菌液，12000g离心10min，收集沉淀，并重悬于10mL的蛋白结合缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL，混匀，冰上放置 30min.超声裂解菌体后，在上清液中加入250μL预处理过的MBP树脂(购于New England公司)或His树脂(购于TaKaRa旗下Clontech公司)，4℃结合2h，然后使用蛋白结合缓冲液洗涤5次，最后使用蛋白洗脱缓冲液将重组蛋白洗脱收集.SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的大小和纯化量.

1.2.6 体外pull-down实验

将等量的MBP-PATL2重组蛋白和MBP蛋白分别与预处理过的MBP树脂相结合，接着加入His-CDKB2；2蛋白，4℃孵育2h.用蛋白缓冲液洗涤5次后，在树脂中加入等量的蛋白上样缓冲液，95℃变性10min后，进行SDS-PAGE电泳，并分别用MBP抗体和His抗体进行Western blot分析.

2 结果与分析

2.1 PATL2互作蛋白CDKB2；2的发现

为了研究PATLs蛋白的生物学功能和发挥作用的分子机制，我们首先获得了PATL2的拟南芥转基因植株35S∶∶PATL2-FlAG：Col-0，使用FLAG树脂在拟南芥细胞中沉淀出与PATL2相结合的蛋白质复合体，并将复合体进行液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定(图1).通过分析获得的肽段信息，我们发现了两个特异肽段qAIFAGDSELQQLLR和QAGQNIPQNTVK，它们都属于一个细胞周期蛋白依赖性激酶CDKB2；2，这说明在拟南芥中PATL2可能与CDKB2；2相互作用，并与之一起发挥一定的生物学功能.

2.2 组织化学方法分析PATL2在拟南芥的组织分布

CDKB2；2在茎顶端分生组织(SAM)的细胞分裂中发挥作用，并且在花中也有一定程度的富集表达[30-31].为了研究PATL2与CDKB2；2是否具有共同的组织分布，我们构建了PATL2启动子驱动的GUS报告基因载体pPATL2∶∶GUS.获得转基因纯合植株后，分别对幼苗和成体植株的各个组织器官进行染色分析.如图2所示，PATL2在植物的各个营养器官和生殖器官中广泛表达.对在长日照培养条件下生长6d的拟南芥幼苗进行的染色分析表明，PATL2在植物的茎尖分生组织和子叶中都有表达(图2(a))，在拟南芥的下胚轴、根以及真叶中也有能检测到PATL2的表达(图2(b)～(d)).角果和花中虽然能够检测到PATL2的表达(图2(e)～(h))，但是PATL2的表达主要集中在角果的两端、花药、柱头和萼片上(图2(f)～(h)).这些结果说明PATL2与CDKB2；2在茎顶端分生组织和花上具有相似的组织分布，这为PATL2和CDKB2；2的相互作用提供了组织水平上的可能性.

2.3 PATL2和CDKB2；2共定位于细胞膜和细胞质

TAIR网站(http：∥www.Arabidopsis.org/)的GO(Gene Ontology)预测分析表明：CDKB2；2可能定位于细胞核，PATL2位于细胞膜和叶绿体中.而SUBA网站(http：∥suba.plantenergy.uwa.edu.au/)则预测CDKB2；2和PATL2均广泛定位于细胞质中.为了分析探究PATL2和CDKB2；2在植物细胞内真正的亚细胞定位，我们在烟草表皮细胞中分别瞬时表达PATL2-mCherry和CDKB2；2-GFP融合蛋白，并通过Leica SP8激光共聚焦显微镜的三维分层扫描技术(3D)进行分析和呈现.在本实验中，我们使用DAPI染料标记细胞核的位置.如图3(见第618页)所示，PATL2定位于细胞膜、细胞质，但是在细胞核中没有表达，而是分布在细胞核周围(图3(a)).与GFP融合表达的CDKB2；2不仅定位于细胞膜、细胞质、细胞核周围，而且CDKB2；2信号与DAPI染色重叠，说明CDKB2；2还定位于细胞核中(图3(b)).这些结果说明除细胞核以外，PATL2和CDKB2；2在细胞膜、细胞质以及细胞核周围均有分布.

为了进一步探究PATL2与CDKB2；2是否在细胞中具有共同的亚细胞定位，我们在同一烟草叶片中同时表达PATL2-mCherry和CDKB2；2-GFP.如图4所示，由于图像获得技术与3D图像不同，2D图像的细胞质信号和细胞核信号看起来比3D图像的弱.PATL2-mCherry的红色荧光信号和CDKB2；2-GFP的绿色荧光信号在细胞膜、细胞质以及细胞核周围重叠为黄色(图4)，说明PATL2和CDKB2；2在细胞水平上共同定位于细胞膜、细胞质以及细胞核周围，这为PATL2和CDKB2；2的相互作用提供了细胞水平上的可能性.

2.4 PATL2和CDKB2；2在植物体外直接相互作用

为了探究PATL2是否与CDKB2；2直接相互作用，我们首先在大肠杆菌表达菌株中表达纯化重组蛋白MBP-PATL2和His-CDKB2；2，同时表达纯化MBP标签蛋白作为对照.通过体外pull-down实验和Western blot检测PATL2与CDKB2；2的相互作用：使用MBP抗体检测实验组MBP-PATL2和对照组MBP的用量，使用His-tag抗体检测实验组和对照组His-CDKB2；2的信号.如图5所示，MBP抗体检测到实验组MBP-PATL2与对照组MBP的用量相同；His-tag抗体检测实验组有较强的杂交信号，而对照组无杂交信号.His-tag抗体检测的Input的杂交信号位置与实验组信号位置一致，说明实验组的蛋白质条带确实代表了His-CDKB2；2蛋白(图5).体外pull-down实验证实了PATL2和CDKB2；2蛋白在体外能够直接相互作用.

2.5 PATL2和CDKB2；2在植物体内相互作用

为了进一步验证PATL2和CDKB2；2在植物体内的相互作用，我们在烟草叶片表皮细胞中共表达黄色荧光蛋白(YFP)C端和PATL2融合的重组蛋白PATL2-cYFP以及黄色荧光蛋白N端和CDKB2；2融合的重组蛋白CDKB2；2-nYFP，用Leica SP8激光共聚焦显微镜观察黄色荧光信号.如图6所示，共转入PATL2-cYFP和nYFP-CDKB2；2的实验组能够在细胞膜和细胞质中观察到黄色荧光信号，而对照组PATL2-cYFP与nYFP、cYFP与nYFP-CDKB2；2和cYFP与nYFP共转后不能观察到黄色荧光信号(图6).这些结果进一步证实了PATL2蛋白和CDKB2；2蛋白在植物叶片细胞中的相互作用，并表明PATL2和CDKB2；2的相互作用部位与它们的亚细胞共定位相吻合，均在细胞膜和细胞质上.

3 讨 论

本研究通过组织化学方法发现PATL2与CDKB2；2在茎顶端分生组织和花器官上具有相似的组织分布.植物的地上部分均起源于茎顶端分生组织内的多能干细胞.植物的茎顶端分生组织内旺盛的细胞分裂源源不断地为植物的胚胎后期发育提供未分化的细胞源，因此植物的茎尖需要具有较高的细胞分裂活性.而植物的正在开放的花中，大量成熟花粉粒的形成也需要较高的有丝分裂和减数分裂活性.本研究的组织化学染色表明PATL2在细胞分裂活性旺盛的茎尖和花药中均有转录分布，这与已报道的CDKB2；2在茎尖和正在开放的花中的富集表达相吻合[30-31].除此之外，CDKB2；2已被证实在茎尖分生组织的细胞分裂过程中发挥重要的作用[30]；PATLs蛋白家族也被报道在细胞分裂中发挥重要的功能[1].PATL2与CDKB2；2在细胞分裂旺盛组织部位的共同转录分布和相互作用暗示它们可能在这些区域共同调控植物的细胞分裂.

本研究通过免疫共沉淀和质谱相结合的方法获得了PATL2的相互作用蛋白CDKB2；2，并且它们之间的作用得到了体外pull-down和BiFC实验的验证.PATL1和PATL2定位于分裂细胞的细胞板上[1]，因此PATLs蛋白在细胞分裂末期，即M期可能参与细胞膜或者细胞壁的形成，进而完成植物特有的胞质分裂过程.而CDKBs蛋白在细胞分裂G2/M期特异表达[19-20，28-29]；对CDKB2双突变体和过表达植株的研究表明，CDKB2缺失会导致细胞分裂异常，茎尖分生组织细胞数目减少、细胞体积变大、细胞核变大，叶片细胞核倍性增加，说明CDKB2蛋白调控了细胞分裂由G2期到M期的转变[30].本研究证明，调控细胞分裂G2/M期的CDKB2；2与处于细胞分裂M期的PATL2在植物体内和体外均可以相互作用，这些结果为研究CDKB2；2在细胞分裂其他时期的作用提供了思路.事实上，一些研究表明，除细胞分裂G2/M期外，CDKB2也在细胞分裂M期和DNA损伤响应中发挥作用[32-34].甚至，水稻中CDKB2；1的绿色荧光蛋白(GFP)并不像细胞周期蛋白B那样在细胞分裂中期就消失，它的荧光信号一直延伸到了细胞分裂末期的细胞板上[33].综上，在今后的研究中，我们既要探究PATL2和CDKB2；2在细胞板形成过程中的作用，也要继续考虑CDKB2；2在细胞分裂其他时期的生物学功能.

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Identification and Validation of the Interaction between Patellin 2 and CDKB2；2 inArabidopsisthaliana

LI Qiong1， WANG Xuelu1，2， SU Wei1

(1. Institute of Plant Biology， School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438， China；2.CollegeofLifeScienceandTechnology，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China)

TheArabidopsisPatellin 2(PATL2) protein is a lipid transfer protein with SEC14 domain and participates in plant cell division given its location at the cell plate. Meanwhile， PATL2 is subjected to phytohormone and environment which may indicate its role in cell division under phytohormone regulation and environment fluctuation.To further study the function of PATL2， we analyzed its expression pattern and screened Patellin 2-interacting proteins using immunoprecipitation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS). Several Patellin 2-interacting proteins including cell division associated kinase CDKB2;2 were detected. Simultaneously histochemical staining results showed that PATL2 widely transcribes in leaves， petals， pollens and at the terminals of siliques， which demonstrates similar distribution with CDKB2；2. PATL2 and CDKB2;2 co-localize on the plasma membrane and in the cytoplasm in tobacco epidermal cells. Pull-down assay showed that PATL2 directly interacts with CDKB2;2invitro， and bimolecular fluorescence complementation(BiFC) experiment further demonstrated theirinvivointeraction.

Patellin 2； CDKB2；2； protein interaction

0427-7104(2016)05-0614-09

2016-02-19

国家自然科学基金(31371231)

李 琼(1990—)，女，硕士研究生；苏 伟，女，副教授，通讯联系人，E-mail：weisu@fudan.edu.cn

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