日本鳗鲡肝脏表达抗菌肽2基因的克隆与表达

段明珠黄 贝梁 英张芳芳聂 品黄文树，

（1. 集美大学水产学院， 厦门 361021； 2. 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心， 厦门 361021； 3. 中国科学院水生生物研究所， 武汉 430072； 4. 福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心， 厦门 361021）

日本鳗鲡肝脏表达抗菌肽2基因的克隆与表达

段明珠1，2黄 贝1，2*梁 英1，2张芳芳1，2聂 品3黄文树1，2，4

（1. 集美大学水产学院， 厦门 361021； 2. 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心， 厦门 361021； 3. 中国科学院水生生物研究所， 武汉 430072； 4. 福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心， 厦门 361021）

为探讨鱼类抗菌肽基因的生物学功能， 研究应用RACE方法克隆获得了日本鳗鲡 （Anguilla japonica） 肝脏表达抗菌肽2基因 （Liver-Expressed Antimicrobial Peptide 2， LEAP-2）， 即AJLEAP-2的cDNA序列， 全长为450 bp， 开放阅读框编码89个氨基酸。其成熟肽含有LEAP-2保守基序“C-X5-C-X4-C-X4-C”。AJLEAP-2基因组结构与其他脊椎动物LEAP-2相同， 都包含有三个外显子。利用荧光定量PCR检测了AJLEAP-2在日本鳗鲡不同组织/器官中的表达， 发现其转录子在肝脏中表达量最高， 是内参基因 （β-actin） 的6倍； 其次是肠道， 但其表达量仅为肝脏的1/130。此外， 还检测了AJLEAP-2在日本鳗鲡玻璃鳗（Glass eel）阶段的转录表达水平， 结果显示， 玻璃鳗中AJLEAP-2的转录表达量仅低于黑仔期的肝脏， 为黑仔鳗肠道表达量的2倍。LPS和迟缓爱德华菌 （Edwardsiella tarda） 刺激能显著上调鳗鲡血液中AJLEAP-2的转录表达， 刺激16h后上调倍数最高， 分别为对照组的86倍和12倍。此外， LPS刺激72h和E. tarda 刺激8h后， 肠道中AJLEAP-2显著上调表达（P＜0.05）， 为对照组的8倍。Poly I:C刺激24h后， 血液中AJLEAP-2转录表达显著下调。结果表明， AJLEAP-2在日本鳗鲡抗细菌感染过程中起重要的作用。

抗菌肽； LEAP-2； 日本鳗鲡； 迟缓爱德华氏菌

抗菌肽 （Antimicrobial peptides） 是一类广谱抗微生物多肽， 可抑制或杀死细菌、真菌、寄生虫和病毒等。同时， 它也是生物体非特异性免疫系统的重要组成部分， 也称宿主防御肽， 广泛存在于动、植物和细菌等生物体［1］。其主要杀菌机理是通过破坏细菌细胞膜的完整性， 使细菌内容物泄漏， 进而杀死细菌［2］。与传统抗生素相比， 抗菌肽具有不易产生耐药性和无环境污染的特性， 被视为现有抗生素的潜在替代品， 近年来已成为研究与开发的热点［3］。

肝脏表达抗菌肽2 （ Liver-Expressed Antimicrobial Peptide-2， LEAP-2 ） 是2003年Krause等［4］从人类血液中分离的一种新抗菌肽， 在中性pH时， 带 +4电荷， pI9.2。其羧基端有4个半胱氨酸残基，C1与C3、C2与C4各自形成二硫键， 因其是第二个在肝脏中发现的大量转录表达的抗菌肽， 故命名为LEAP-2。人类LEAP-2的cDNA全长为512 bp， 包含3个外显子， 2个内含子， 基因编码77个氨基酸， 包含信号肽， Prodomain域和成熟肽三部分。在血液中，LEAP-2被加工成几种不同长度的多肽， 参与抗菌活动［4，5］。抗菌活性研究发现， 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）等对重组表达和化学合成的LEAP-2都具有敏感性， 其抗菌活性与膜的亲和性相关［6］。

在鱼类中， Zhang等［7］首先从虹鳟 （Oncorhynchus mykiss） 克隆获得两个LEAP-2， 即LEAP-2A和LEAP-2B，分析发现LEPA-2存在RXXR切割位点， 酶切后形成成熟肽， 并且LEAP-2A和LEAP-2B在肝脏中均高水平转录表达， 经细菌刺激后， 肠和皮肤的转录表达量增加［7］。迄今， 已有包括斑点叉尾（Ictalurus punctatus）［8］、黄颡鱼 （Pelteobagrus fulvidraco）、牙鲆 （Paralichthys olivaceous）［9］、斑马鱼 （Danio rerio）［10］、蓝鲶 （Ictalurus furcatus）［8］、草鱼 （Ctenopharynodon idellus）［11］、团头鲂 （Megalobrama amblycephala）［12］、鲤 （Cyprinus carpio ）［13］、（Miichthys miiuy）［14］、大西洋鲑 （Salmo salar）、鲫 （Carassius auratus）［15］和大黄鱼 （Larimichthys crocea）［16］等13种鱼的LEAP-2基因被克隆鉴定。与哺乳动物LEAP-2主要表达于肝脏组织中不同， 鱼类LEAP-2的组织表达模式差异较大。例如， 斑点叉尾LEAP-2在肝脏中的转录表达量远低于其他组织/器官［8］，而团头鲂LEAP-2 在中肠中转录表达水平最高， 其次是脑垂体［12］。此外， 硬骨鱼类LEAP-2受外源刺激物诱导后， 转录表达模式具有一定的种属特异性［12］。如灭活的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）刺激4h后， 草鱼肝脏中LEAP-2转录表达量上调倍数最高［11］。而灭活嗜水气单胞菌刺激72h后，团头鲂肝脏中LEAP-2的转录表达才达到高峰。

鳗鲡是中国重要的养殖鱼类， 近十年来， 鳗鲡养殖业稳定发展， 2013年， 中国鳗鲡产量达到20.6万吨， 主要集中在福建、广东和江西三省［17］。在鳗鲡养殖所发生的各种疾病中， 细菌性疾病危害最严重［18］。据调查测算， 2006年福建省养殖鳗鲡发生的疾病中， 细菌性疾病所占比例最高， 约为43%［19］。自2006年日本实施“肯定列表制度”， 对中国输日鳗鲡的药物残留进行严格控制， 给中国养鳗业造成了巨大压力。因此， 针对鳗鲡细菌性疾病的抗菌肽的研究开发显得尤为迫切。本研究克隆鉴定了日本鳗鲡抗菌肽LEAP-2基因， 并利用荧光定量PCR技术研究了该基因在日本鳗鲡各组织/器官中的表达模式， 及外源刺激后基因表达的变化， 研究结果将有助于深入了解日本鳗鲡的抗菌机制， 丰富鱼类先天免疫的理论。

1 材料与方法

1.1 实验材料

日本鳗鲡［体质量（203±53） g］ 购于福建省集美大学水产养殖基地， 养殖水温 （28±2）℃；玻璃鳗［20］［体长（6±2） cm］购于福建省莆田市。对日本鳗鲡（黑仔鳗）采集血液、鳃、心脏、肝脏、肠、胃、脾脏、头肾、中肾、鳔和皮肤组织/器官， 玻璃鳗采集整条。黑仔鳗样品采集及处理方法：用肝素钠预处理的无菌注射器抽取鳗鲡血液2 mL， 800×g离心20min， 去上层溶液， 收集下层细胞， 加入1 mL Trizol®reagent （Invitrogen， 美国） 和6—7颗直径3 mm玻璃珠， 组织匀浆（3000 r/min， 20s/次， 匀浆3次， Retsch MS100， 日本）； 其他组织取约100 mg，同上加入玻璃珠及1 mL Trizol后， 匀浆。取整条玻璃鳗剪碎后， 同上加入玻璃珠及1 mL Trizol后， 匀浆。上述样品于-80℃保存， 备用。

免疫刺激试验: 设PBS对照组， LPS刺激组（1 mg/ 100 g鱼， Sigma）， Poly I:C刺激组（1 mg/100 g鱼，Sigma）， 迟缓爱德华氏菌刺激组（2×107cfu/100 g鱼），免疫方法是腹腔注射。分别在注射后8h、16h、24h和72h采样， 每组每个时间点随机取鳗鲡8尾， 每尾鱼分别采集上述11个组织/器官。

1.2 基因组DNA和总RNA的提取

DNA提取: 取日本鳗鲡肌肉100 mg， 参照 Mini-BEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0 （TaKaRa， 日本）试剂盒提取基因组DNA。RNA提取: 取解冻后的组织样品200 μL， 根据Trizol®reagent试剂盒说明书提取总RNA， 每尾鱼的不同组织/器官作为独立样品提取RNA。琼脂糖凝胶电泳法检测总RNA/DNA的完整性， 利用分光光度计（Thermo， NanoDrop 2000， 美国）检测RNA或DNA的浓度及纯度。

1.3 cDNA第一链的合成

基因克隆: 取肝脏总RNA， 经RNase-free DNase I （New England Biolabs Inc， 美国） 处理后， 反转录（SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit，Clontech， 美国）合成第一链， 制备肝脏3′和5′RACE模板。

Real-time PCR扩增模板制备: 取4 μg总RNA用GoScripTMReverse Transcription System （Promega，美国） 反转录试剂盒反转录， 产物用TE buffer稀释，于-20℃保存， 备用。

1.4 AJLEAP-2全长cDNA的克隆和序列测定

通过分析日本鳗鲡肝脏和肾脏cDNA文库， 获得一条与鲤LEAP-2相似性为65%的EST序列， 根据EST序列设计引物（Primer Premier 6.0 软件） （表1），按照SMARTer试剂盒的说明书进行巢式PCR， 获得5′和3′末端基因片段。利用所获得的5′和3′末端序列， 设计引物AJLEAP-2_FL_F和AJLEAP-2_FL_R（表 1） 进行PCR扩增和全长cDNA验证［21］。PCR产物于1.2%琼脂糖胶上电泳， 回收 （E.Z.N.A®Gel Extraction Kit， OMEGA， 美国）， 连接到pMD19-T载体（TaKaRa， 日本）， 并热激转化至大肠杆菌Escherich coliDH5α中。经PCR检测阳性克隆后测序验证。

表 1 所用引物序列Tab. 1 Primers used in the present study

1.5 AJLEAP-2基因组序列扩增

用扩增cDNA全长的引物（AJLEAP-2_FL_F和AJLEAP-2_FL_R， 表1）， 以肌肉基因组DNA为模板，进行PCR扩增 （LA试剂盒， TaKaRa， 日本）， 反应体系25 μL: 基因组DNA 1 μL， 上下游引物（10 μmol/L）各1 μL， LA Taq DNA 聚合酶（5 U/μL） 0.25 μL，10×LA PCR Buffer II （Mg2+Plus） （TaKaRa， 日本）2.5 μL， dNTP Mixture （2.5 mmol/L） 4 μL， 反应条件为: 94℃预变性3min； 94℃变性30s， 64℃退火30s，72℃延伸2min， 35个循环； 72℃ 10min。

1.6 AJLEAP-2在日本鳗鲡不同组织器官表达量分析

荧光定量PCR采用Lightcycler 480 SYBR Green I 试剂盒 （Roche， 德国） 在Ligthcycler 480 II PCR仪 （Roche， 德国） 上进行。PCR反应体系: cDNA模板4 μL， 正向引物 （qAJLEAP-2F， 跨内含子， 10 μmol/L 0.5 μL），反向引物 （qAJLEAP-2R，10 μmol/L） 0.5 μL， LightCycler 480 SYSR Green I Master （2×） 10 μL， 补充水至20 μL。反应条件：95℃变性20s， 58℃退火20s， 72℃延伸25s， 40个循环。荧光信号采集温度为81℃。反应结束后分析扩增产物的溶解曲线， 以判定扩增产物的特异性。以β-actin作为内参比基因。梯度稀释已知拷贝数AJLEAP-2和β-actin质粒样品， 与组织/器官样品同时进行PCR扩增， 绘制标准曲线， 计算各自基因的扩增效率。

不同组织/器官中AJLEAP-2的转录表达谱， 是以不同组织/器官中（AJLEAP-2表达量）/（β-actin表达量）的1000倍来表示。不同免疫源刺激实验组的AJLEAP-2相对表达量的倍数变化， 是以相应时间点的相同组织的PBS对照组靶基因表达量为基准计算所得。

1.7 序列生物信息学分析

利用NCBI网站中的Blast （http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi） 进行序列比对； 利用ExPASy的翻译工具（http://web.expasy.org/translate/） 获得LEAP-2的氨基酸序列； ExPASy （http://web.expasy. org/compute_pi/）预测分子量和pI值； 用SignalP 4.1 Server程序 （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析信号肽； 用Pfam程序（http://pfam.xfam.org/）分析结构域； SWISS-MODEL程序（http://swissmodel. expasy.org/） 预测LEAP-2基因的三级结构。利用ClustalX-2.1软件进行氨基酸序列的多重比对； 应用MEAG5.0软件， 采用邻位相接法 （NJ法） 构建了系统发育树。基因组数据来源于Ensembl网站（http:// asia.ensembl.org/index.html）。

1.8 数据统计分析

数据结果用Excel软件进行计算， 用单因素变量方差分析法 （ANOVA） 分析免疫原刺激样品间AJLEAP-2表达量差异， 利用 Dunnettt-Test （2-sided）进行多重比对。所有数据均用平均值±标准误差（SEM） 的方式表示， P＜0.05 表示差异显著， P＜0.01表示差异极显著。利用GraphPad.Prism.v5.0软件进行作图。

2 结果

2.1 日本鳗鲡AJLEAP-2基因序列分析

通过RACE 和PCR的方法克隆获得日本鳗鲡LEAP-2 （AJLEAP-2） 的全长cDNA 序列（GenBank登录号: KP893812）。AJLEAP-2 cDNA全长450 bp，包括5′ UTR 60 bp、开放阅读框（ORF） 270 bp和3′UTR 120 bp， 其中3′ UTR中有保守的终止信号（AATAAA）。推导的AJLEAP-2前体肽分子量为9.66 kD， pI为9.33。该前体肽包括三个部分： N-端26氨基酸残基为信号肽部分； 随后22个氨基酸残基为原结构域 （Prodomain），该结构域的C-末端含有成熟肽切割位点（RXXR）； C-末端的41个氨基酸残基为成熟肽 （其分子量为4.78 kD， pI 8.86）， 含有哺乳动物和鱼类LEAP2高度保守的4个半胱氨酸残基，其基序为-C-X5-C-X4-C-X4-C-，其中C65与C76、 C71与C81可能形成二硫键。

高等脊椎动物 （哺乳类和鸟类） LEAP-2原前体肽 （Proprepeptide） 为76—77肽， 其中信号肽部分含22个氨基酸残基， 成熟肽为40肽， pI为9.37； 两栖类LEAP-2的前体肽为80肽， 信号肽为24肽， 成熟肽为40肽， pI为9.58； 而鱼类LEAP-2的前体肽较为多样，总长度为78—102个氨基酸残基， 成熟肽包含37—46个氨基酸残基， 成熟肽的pI 6.79—9.2。根据信号肽、Prodomain及成熟肽的长度和等电点不同，鱼类的LEAP-2可以区分为三型， 即A、B、C型: 高等脊椎动物和硬骨鱼C型LEAP-2成熟肽的长度小于或等于40个氨基酸残基， 而硬骨鱼A、B型的均大于40个氨基酸残基（表 2）； 高等脊椎动物和硬骨鱼的C型LEAP-2的Prodomain区长度小于18个氨基酸， 而硬骨鱼的A和B型的较大， 一般大于22个氨基酸 （表 2）； 哺乳类、鸟类、两栖类和大多数的硬骨鱼C型的成熟肽pI大于9， 硬骨鱼A型的pI为7—9， 而硬骨鱼B型的pI （除虹鳟为8.94） 均小于7 （表 2）。

表 2 各物种LEAP-2基因的GenBank登录号及序列信息Tab. 2 GenBank accession number and sequence information for LEAP-2 genes in vertebrates

利用AJLEAP-2_FL_F和AJLEAP-2_FL_R引物对日本鳗鲡基因组进行LA-PCR扩增， 获得AJLEAP-2基因组序列， GenBank登录号为: KR013137。用Spidey软件对基因组序列与cDNA序列进行比对，结果显示， AJLEAP-2的开放阅读框包含三个外显子 （69、161和40 bp）和两个内含子（868和110 bp），内含子1属于0相位， 内含子2属于2相位， 内含子剪切符合GT-AG规则。信号肽部分由外显子1及外显子2的部分序列共同编码， 成熟肽部分由外显子2的部分序列和外显子3共同编码。基因组结构比对分析结果显示， 脊椎动物LEAP-2基因的基因结构保守， 外显子大小相近。哺乳类和大多数硬骨鱼类的内含子相位相同， 内含子1均是为0相位（除鸡为1），内含子2均为2相位（除石首科的大黄鱼和鮸为0）（表 3）。脊椎动物LEAP-2的四个保守半胱氨酸的编码高度保守， 前3个半胱氨酸由外显子2编码， 第4个半胱氨酸由外显子3编码， 除爪蟾为前2个半胱氨酸由外显子2编码， 后2个半胱氨酸由外显子3编码。

2.2 LEAP-2的多重比对及系统发育树构建分析

选取哺乳类、鸟类、两栖类和硬骨鱼类等17个代表性物种的21条LEAP-2的全长氨基酸序列进行多重比对。结果显示， 所有脊椎动物LEAP-2的原前体肽包括信号肽、Prodomain区和成熟肽三个部分。哺乳类、鸟类、两栖类和硬骨鱼C型LEAP-2氨基酸全长、信号肽、Prodomain区和成熟肽长度均小于硬骨鱼A、B亚型。Prodomain区内都有保守基序为“RXXR”， 它是成熟肽的切割位点， 硬骨鱼类LEAP-2A （包括AJLEAP-2基因） 的蛋白酶水解位点基序均为“RXAR”， LEAP-2B （除虹鳟LEAP-2B为RRTR） 为“RKXR”， LEAP-2C型为“RATKR”序列（表 2）。在成熟肽的N端包含有6个高度保守的氨基酸序列: 高等脊椎动物为“M/ITPFWR”， 硬骨鱼类LEAP-2A（包括AJLEAP-2）为“MTPLWR”， LEAP-2B（除虹鳟LEAP-2B为MTPLWR）为“MSPLWR”， 而LEAP-2C少一个氨基酸“M”为“SLLWR”。

相似性分析结果显示日本鳗鲡AJLEAP-2的氨基酸序列与哺乳动物、鸟类、两栖类及其他鱼类的相似度12%—57.2%，其中与虹鳟的相似度最高为57.2%。

用MEAG 5.0软件对9个物种的15条LEAP-2成熟肽序列构建进化树。结果显示， 哺乳类、鸟类和两栖类的LEAP-2聚为一支， 硬骨鱼聚成另一支。其中硬骨鱼LEAP-2的A、B、C型又分别聚在不同的小分支中， 其中本研究的AJLEAP-2与虹鳟、斑马鱼、鲤和大黄鱼LEAP-2A亚型聚为一支， 鱼类LEAP-2B亚型与LEAP-2A型进化关系接近， 2B先聚为一小支 （虹鳟LEAP-2B与鱼类LEAP-2A聚为一支）后与LEAP-2A聚为一支， 鱼类LEAP-2C亚型聚为一支， 三种亚型最后聚为一大支后， 而高等脊椎动物LEAP-2聚为另一大支 （图 1）。

2.3 日本鳗鲡LEAP-2三级结构预测

表 3 日本鳗鲡LEAP-2与其他脊椎动物LEAP-2基因组结构比较Tab. 3 Comparison of the genomic organization of AJLEAP-2 gene with its counterparts from other vertebrates

通过最佳模型的搜索发现，AJLEAP-2蛋白序列最匹配的模板是人类LEAP-2 （PDB 2l1q.1.A）， 用SWISS-MODEL预测日本鳗鲡LEAP-2蛋白的三级结构（图 2）。结果显示， 日本鳗鲡LEAP-2与人类LEAP-2蛋白结构相似， 包括由两对二硫键组成的紧密中心和无序的N端、C端组成一个稳定的结构。

图 1 脊椎动物AJLEAP-2基因系统发育分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of AJLEAP-2 mature peptide amino acid sequences from vertebrate

2.4 AJLEAP-2基因的组织特异性表达

利用Real-time PCR检测日本鳗鲡（黑仔鳗）的肝脏、肠、皮肤、心脏、血液、胃、头肾、中肾、鳔、脾脏、鳃等11个组织/ 器官AJLEAP-2的转录表达水平， 结果显示， AJLEAP-2在所检测的不同组织/器官中均有转录表达； 其中肝脏中的表达量最高，其平均表达量是β-actin的6倍； 其次是肠， 但其表达量仅为肝脏的1/130， 在血液， 皮肤等中表达量也相对较高。此外， 我们还检测了玻璃鳗的AJLEAP-2基因的转录表达水平。结果显示， AJLEAP-2在玻璃鳗中的表达量虽然不及黑仔鳗期的肝脏表达量，但比黑仔鳗期的其他组织/器官表达量都高， 约为肠道表达量的2倍 （图 3）。

2.5 免疫刺激后AJLEAP-2的基因表达变化

与对照组相比， LPS刺激后16h， 血液中AJLEAP-2转录表达量上调了86倍 （P＜0.05）， 在肠中， 刺激后72h显著性上调8倍 （P＜0.05）， 而肝脏则在24h显著性下调 （P＜0.05）（图 4A）。Poly I:C刺激后， 血液中AJLEAP-2基因早期无显著变化， 到24h和72h显著性下调 （P＜0.05）， 而肠和肝脏中的AJLEAP-2无显著性差异 （P＞0.05）（图 4B）。迟缓爱德华氏菌刺激后，血液中的AJLEAP-2在16h显著性上调12倍 （P＜0.05）， 而在24h和72h均显著下调 （P＜0.05）。肠中的AJLEAP-2在被检测的时间点均上调， 在8h具有显著性差异 （P＜0.05）， 上调8倍。肝脏中的AJLEAP-2在被检测的时间点均无显著性差异（P＞0.05）（图4C）。

3 讨论

LEAP-2是一种富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽，首次从人类血液的超滤液中纯化获得， 后被发现在肝脏中大量表达［4］，在脊椎动物抗细菌免疫应答的过程中起十分重要的作用［11，19，23］。本研究克隆了日本鳗鲡的LEAP-2基因全长cDNA序列， 在解析其基因结构的基础上， 对其表达模式进行了研究。

图 2 日本鳗鲡LEAP-2蛋白三级结构预测Fig. 2 Predicted tertiary structure of Anguilla japonica LEAP-2

虽然氨基酸序列相似性分析结果显示AJLEAP-2与高等脊椎动物LEAP-2基因的相似性较低（12%—23%）， 但是， 其与其他硬骨鱼类LEAP-2基因的相似性较高 （54.6%—57.2%）。此外， 基因结构分析结果显示， 日本鳗鲡LEAP-2基因结构与已报道脊椎动物LEAP-2的结构类似， 由3个外显子和2个内含子组成， 且硬骨鱼类LEAP-2基因的外显子大小相近， 表明其在鱼类的进化中保持较高的保守性。

图 3 AJLEAP-2基因在健康黑仔鳗期不同组织/器官和玻璃鳗中相对表达量Fig. 3 Tissue expression of AJLEAP-2 in glass eels and different tissues/organs from Japanese eel elver

Li等［16］通过系统进化分析， 将鱼类LEAP-2分为三个亚型， 即LEAP-2A、LEAP-2B和LEAP-2C。本研究对A、B、C三型进行分析， 结果发现三种类型在基因长度， 特征序列， 成熟肽等电点等方面具有差别， 其中A型和B型除成熟肽等电点外， 其他特征较为接近， 而C型基因长度， 特征序列， 成熟肽等电点等都与高等脊椎动物的LEAP-2特征相近， 进化系统进化分析结果显示A型和B型同源关系较近， C型与两者关系较远。因此， 结合系统进化分析、氨基酸序列比对及等电点分析， 我们认为本研究所克隆获得的AJLEAP-2为A型， Zhang等［7］所报道的虹鳟LEAP-2B成熟肽的特征序列和等电点等特征更接近于其他硬骨鱼类的LEAP-2A。

图 4 LPS（A）、PolyI:C（B）和爱德华氏菌（C）刺激后AJLEAP-2表达量变化分析Fig. 4 Differential expression of AJLEAP-2 in Anguilla japonica after being intraperitoneal injected with LPS（A）， Poly I:C （B） or Edwardsiella tarda （C）

脊椎动物的LEAP-2基因在各组织/器官中广泛表达， 且主要表达于肝脏中［16］。人类LEAP-2在肝、肾、十二指肠、空肠等组织/器官中表达［4］。猪LEAP-2主要表达于肝脏， 在肾和肠也有表达［24］。鸡LEAP-2表达于肝、小肠、肺、和肾脏［22］。多数硬骨鱼LEAP-2也是在肝脏中表达量最高［7，11，13，14］。但也有例外， 如斑点叉尾LEAP-2A在肝脏中的表达量远远低于其他组织/器官［8］， 鲤LEAP-2A在脾脏中表达量最高［13］， 大黄鱼LEAP-2A和LEAP-2C亚型均在肠中表达量最高， 其次才为肝脏［16］。在本研究中，AJLEAP-2主要表达于肝脏， 其次在肠、心脏、皮肤、血液、胃、头肾、中肾、鳔、脾脏和鳃。这些结果表明鱼类LEAP-2基因的表达模式具有种属特异性［12］。有研究表明， LEAP-2参与了鱼类早期发育过程中的免疫应答。如草鱼LEAP-2在16细胞期和团头鲂LEAP-2受精卵发育开始高表达， 随后表达量开始降低， 孵化后LEAP-2又重新高表达［11，12］。本研究发现在日本鳗鲡玻璃鳗时期， AJLEAP-2高表达， 说明LEAP-2参与了日本鳗鲡幼体时期的先天免疫反应。

已有的研究表明， 细菌或其成分（如LPS）刺激能够显著诱导LEAP-2的表达。灭活嗜水气单胞菌刺激可显著上调草鱼肝脏、脾脏、脑和鳃组织中LEAP-2基因的表达［11］。腹腔注射鳗弧菌6h后， 鲤肝脏、脾脏、头肾、皮肤、鳃和前肠组织中LEAP-2基因显著上调表达［13］。大黄鱼感染溶藻弧菌后，其肝脏组织中LEAP-2A基因快速上调表达［16］。本研究发现， LPS和迟缓爱德华菌刺激能显著上调日本鳗鲡血液中AJLEAP-2基因的表达， 刺激16h上调倍数最高， 分别为对照组的86倍和12倍。此外LPS刺激72h和E. tarda 刺激8h后， 肠AJLEAP-2显著上调表达， 为对照组的5—8倍。而Poly I:C刺激后，AJLEAP-2在肝脏和肠中表达无显著变化， 且在刺激24h后血液中AJLEAP-2表达量显著下调， 表明AJLEAP-2基因主要参与鱼类抗细菌免疫应答。

综上所述， 本研究克隆获得了日本鳗鲡LEAP-2基因。结合其基因结构、分子特性和系统进化分析， 推断该分子为硬骨鱼类LEAP-2A亚型。此外，本研究检测了LPS、迟缓爱德华菌和Poly I:C刺激后， 日本鳗鲡LEAP-2基因的表达模式， 结果进一步证实了该基因主要参与鱼类的抗细菌免疫应答。

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MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF A LIVER
EXPRESSED ANTIMICROBIAL PEPTIDE-2 IN JAPANESE EEL， ANGUILLA JAPONICA

DUAN Ming-Zhu1，2， HUANG Bei1，2， LIANG Ying1，2， ZHANG Fang-Fang1，2， NIE Pin3and HUANG Wen-Shu1，2，4
（1. Fishery College， Jimei University， Xiamen 361021， China； 2. Engineering Research Center of the Modern Technology for Eel Industry， Ministry of Education PRC， Xiamen 361021， China； 3. Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430072， China； 4. Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources，Xiamen 361021， China）

Liver Expressed Antimicrobial Peptide 2 （LEAP-2）， a cysteine-rich cationic antimicrobial peptide， plays a vital role in the host innate immune system. In the present study， the AJLEAP-2 gene was cloned from Japanese eel （Anguilla japonica） by RACE. The length of AJLEAP-2 cDNA was 450 bp including a 270 bp ORF that encodes a putative 89-peptide. The peptide contained the conserved motif MTPFWR and the characteristic motif C-X5-C-X4-C-X4-C of LEAP-2. AJLEAP-2 has three exons similar to the counterpart from other vertebrates. The expression of AJLEAP-2 from tissue/organs of Japanese eel elver indicated the highest expression in liver that was five times higher than that of β-actin， and then in intestine that was only 1/130 the amount in liver. Additionally， AJLEAP-2 was highly expressed in glass eel， which was almost twice the amount in elver intestine. LPS and Edwardsiella tarda increased the expression of AJLEAP-2 in blood and reached the peak level at 16h post challenge increasing 86 folds and 12 folds， respectively. Both LPS and E. tarda significantly up-regulated the expression of AJLEAP-2 in intestine. Meanwhile， the transcript level of AJLEAP-2 in blood was significantly down-regulated at 24h challenged with Poly I:C. These results suggest that AJLEAP-2 may play an important role in innate immunity of Japanese eel against bacterial infection.

Anguilla japonica； LEAP-2； Antimicrobial peptide； Edwardsiella tarda

10.7541/2016.35

Q344+.1

A

1000-3207（2016）02-0252-09

2015-06-07；

2015-08-18

国家自然科学基金（31172438和U1205123）； 福建省自然科学基金（2012J06008， 201311180002和2014J05042）； 教育部留学回国人员科研启动金资助 ［Supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 31172438 and U1205123）， the Natural Science Foundation of Fujian Province （Nos. 2012J06008， 201311180002 and 2014J05042） and the Projects-sponsored by SRF，for ROCS， SEM］

段明珠（1989-）， 女， 湖北黄冈人； 硕士； 主要研究方向为鱼类免疫学。E-mail: dmzstiver@sina.cn； 黄贝（1982—）， 男， 江西萍乡人； 博士； 主要研究方向为鱼类免疫学。E-mail: huangbei@jmu.edu.cn *共同第一作者

黄文树， 男， 博士； E-mail: wshuang@jmu.edu.cn