鳜肝脏和心脏生物钟基因表达节律分析

鄢慧玲褚武英吴 萍，汪建华，刘小燕张建社

（1. 湖南农业大学动物科学技术学院， 长沙 410128； 2. 长沙学院生物与环境工程系， 长沙 410003；3. 湖南大学生物学院， 长沙 410082； 4. 广西师范大学生命科学学院， 桂林 541004）

鳜肝脏和心脏生物钟基因表达节律分析

鄢慧玲1，2褚武英2吴 萍2，3汪建华2，4刘小燕1张建社2

（1. 湖南农业大学动物科学技术学院， 长沙 410128； 2. 长沙学院生物与环境工程系， 长沙 410003；3. 湖南大学生物学院， 长沙 410082； 4. 广西师范大学生命科学学院， 桂林 541004）

在12h光照、12h黑暗交替（Light-Dark； LD）光制下， 研究分析了褪黑素和皮质醇水平在鳜血清中的昼夜变化规律， 以及13个生物钟基因（Arntl1、Clock、Cry1a、Cry3、Cry-dash、Npas2、Npas4、Nr1d1、Nr1d2、Per1、Per3、Rora和Tim）在鳜（Siniperca chuatsi）肝脏和心脏中的昼夜表达规律。试验在一昼夜内的ZT0（06:00）、ZT3（09:00）， ZT6（12:00）， ZT9（15:00）， ZT12（18:00）， ZT15（21:00）， ZT18（24:00）， ZT21（03:00， 2ndd），ZT24（06:00， 2ndd） （Zone time， ZT） 9个时间点随机抽取3尾鳜采集其血清、肝脏和心脏。经SPSS 单因素方差分析和Matlab余弦分析， 结果显示: 鳜血清中褪黑素和皮质醇含量均呈现出昼夜节律性振荡， 褪黑素含量白天显著降低（P≤0.05）， 夜间显著上升， 皮质醇含量白天缓慢降低， 夜间ZT15（21:00）-ZT18（24:00）显著升高， 随后开始缓慢降低； 两种激素最低相位都为ZT15（21:00）。在13个生物钟基因中， Cry-dash、Npas4、Nr1d1、Per1和Tim 5个基因在鳜肝脏内具有明显的昼夜节律性， 其中Npas4、Nr1d1、Per1、Tim的表达规律相似， 皆呈现出光照阶段表达降低， 黑暗阶段表达升高的趋势； 但Cry-dash则表现出光照阶段先升高后降低， 黑暗阶段先降低后升高的规律。在鳜心脏中， Arntl1、Clock、Cry1a、Npas2、Nr1d1、Nr1d2、Per3、Rora和Tim 9个基因都表现出明显的昼夜节律， 表达趋势分为两种: Arntl1、Clock、Nr1d2的表达量在光照阶段降低， 黑暗阶段升高； 而Cry1a、Npas2、Nr1d1、Per3、Rora和Tim的表达量在ZT0（06:00）-ZT15（21:00）持续低水平，ZT15（21:00）-ZT18（24:00）表达量显著上升， ZT18（24:00）-ZT21（03:00）表达量降低。研究结果表明: 生物钟基因在鳜肝脏和心脏中所表达的昼夜节律不同。

鳜； 昼夜节律； 生物钟基因； 褪黑素； 皮质醇

昼夜节律是一种普遍存在于各种生物体内的周期约为24h的生理现象。机体的睡眠-苏醒循环、体温的波动、激素水平的涨落、识别和记忆能力的变化等都具有昼夜节律性， 其标志是机体核心温度和血浆中褪黑素、皮质醇的水平［1］。生物体通过褪黑素和皮质醇分泌的昼夜节律的改变， 将外界信息传递给体内有关的组织器官， 使各组织内相关生物钟基因的表达作出相应的改变， 从而使它们的功能活动适应环境的变化［2］。即使在缺乏外界因素的条件下， 如光照和温度等， 昼夜节律仍能维持原有的生理周期， 具有内源性和自我维持运转的特点［3］。昼夜节律发生的物质基础是分子计时器， 即昼夜节律生物钟， 所有的机体生命活动和生理功能都受到生物钟的调控［4，5］。

在多细胞生物中， 昼夜节律生物钟可分为主钟（中枢钟）和外周钟（细胞钟）。主钟位于中枢部位，外周钟位于组织（肾脏、心脏、肝脏、骨骼肌等）细胞内［6］。生物钟系统主要由三部分构成: 输入通道、核心振荡器和输出通道［7，8］。外界环境中的光和温度等变化由输入途径传送至核心振荡器， 并经过一系列的反应， 通过输出途径驱动生物节律的产生。非哺乳类脊椎动物的核心振荡器位于松果体内［9］， 是一种“转录-翻译-抑转录”机制构成的反馈环， 其中的生物钟基因在许多物种中表达高度保守［10］。在哺乳动物中， 位于主反馈环路的基因包括Clock及其同源基因Npas2、Arntl1、Per1、Per2、Cry1、Cry2［7］。其中正向调节因子包括Clock和Arntl1， 抑制因子包括Per和Cry。为保证节律振荡的精确性和稳定性， 还存在另一个反馈环路， 该调节环路包括了通过Clock: Arntl1二聚体转移活化的维A酸相关孤核受体Rora［11］， 且Rora能激活Arntl1的转录。

Science Foundation of China （31472256， 31230076）； Hunan Provincial Natural Science Foundation of China （14JJ2135）］

目前在鱼类中， 生物钟基因的研究对象主要为一些模式物种， 如斑马鱼（Danio rerio）、红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）、绿河豚（Tetraodon nigroviridis）、青鳉（Oryzias latipes）等［12—14］； 仅有少量的养殖物种， 如欧洲鲈（Dicentrarchus labrax）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、大西洋鲑（Salmo salar）、大西洋鳕（Gadus morhua）等［15—20］进行过生物钟相关研究。鳜作为一种典型的肉食性鱼类， 有着肉食鱼类的生活共性， 是研究昼夜节律的理想的非模式动物。本试验旨在通过对鳜（Siniperca chuatsi）LD光制（06:00—18:00为光照期， 18:00至第2天06:00为黑暗期， 模拟自然光照条件下约06:00天亮， 18:00天黑的模式）下褪黑素和皮质醇水平的测定， 分析昼夜阶段鳜激素水平的差异性， 以及对肝脏及心脏中各生物钟基因mRNA表达量的测定， 检验分析各基因在不同组织器官内mRNA表达的昼夜节律性， 初步探讨鳜的昼夜生理规律， 为进一步研究鳜昼夜节律的调节机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验样品采集及处理

试验鳜为翘嘴鳜， 取自常德兴达鳜繁养场， 皆为体重（500±50） g的成鱼， 共54尾， 随机分为9组， 每组分别养殖于同一规格的不同水族箱内， 在LD光制（12h光照， 12h黑暗）下驯养21d后取样。样品的采集在一昼夜内进行， 每间隔3h（每个时间点分别为06:00、09:00、12:00、15:00、18:00、21:00和24:00、第2天03:00、06:00； 分别对应区时（Zone time， ZT） ZT0、ZT3、ZT6、ZT9、ZT12、ZT15、ZT18、ZT21和ZT24）在同一组中随机抽取3尾鳜于尾静脉处用5 mL无菌注射器抽取3 mL新鲜血液，分开放入1.5 mL离心管中， 4℃静置过夜， 隔天用离心机2000 r/min离心15min， 血清充分析出后用200 µL移液枪将血清吸取至无菌离心管内， -80℃冰箱中保存备用； 每个时间点抽血后的3尾鳜立即活体解剖取其肝脏和心脏， 迅速置于液氮内， 随后于-80℃冰箱保存备用。

1.2 褪黑素的测定

血清褪黑素测定按照鱼褪黑素（Melatonin）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒（路非凡生物科技有限公司）的操作说明书进行， 最后于酶标仪（Thermo scientific Multiskan GO）上测定结果。

1.3 皮质醇的测定

根据鱼皮质醇（cortisol）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒（路非凡生物科技有限公司）使用说明书的方法操作， 样品为鳜血清， 最终结果采用酶标仪（Thermo scientific Multiskan GO）进行测定。

1.4 总RNA提取

采用Trizol法将采集的鳜肝脏及心脏提取总RNA， 并在1%的琼脂糖/GoldView凝胶中对所提取的总RNA质量和浓度进行电泳检测。

1.5 cDNA合成

逆转录按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）试剂盒使用说明将总RNA合成为cDNA模板。反应体积为20 μL，反应条件为: 42℃ 2min； 37℃ 15min； 85℃ 5s；-40℃冰箱内保存。

1.6 引物设计及合成

根据GenBank中已登录的鳜（Siniperca chuatsi）Arntl1 （KP702269）、Clock （KP702271）、Cry1a（KP702272）、Cry3 （KP702274）、Cry-dash（KP702275）、Npas2 （KP702276）、Npas4 （KP702277）、Nr1d1 （KP702278）、Nr1d2 （KP702279）、Per1（KP702280）、Per3 （KP702282）、Rora （KP702283）、Tim （KP702284）和RPL13 （BC063378）的序列， 用Primer premier 5.0软件设计用于荧光定量PCR反应的特异性引物（表 1）， 引物由上海铂尚公司合成。

1.7 荧光定量PCR

分别取鳜肝脏和心脏总RNA逆转录合成的cDNA模板在荧光定量PCR仪（BIO-RAD CFX96TMReal-Time System）上进行qRT-PCR反应， 总反应体积为25 µL， 反应体系为: TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMII （Tli RNaseH Plus） 12.5 μL， dH2O 10.5 μL，cDNA 1 μL， 上下游引物各0.5 μL。PCR反应程序为: 95℃ 1min； 95℃ 5s； 56℃ 30s； 39个循环。将RPL13设为内参， 每个待测样品和内参均设3个重复。

1.8 数据分析

荧光定量数据用Bio-Rad CFX Manager软件导出至Excel 2007后进行初步处理， 按照公式2-ΔΔCt计算出目的基因的表达量。用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）， P≤0.05表示具有时间差异显著性。用MatLab软件进行余弦分析，拟合的余弦方程为: ƒ（t）=M+Acos（t/pi/12-φ）； 其中ƒ（t）是指在给定时间基因的表达水平； M为中值， 即波动变化的中线； A为节律振荡的振幅； φ为峰值相位， 是振荡达到峰值的时刻， 可根据（360°/24h）将其换算成ZT时间点； 通过计算噪声/信号振幅比SE（A）/A（P＜0.3）来鉴定基因表达的节律性。同时满足ANOVA（P≤0.05）和余弦分析SE（A）/A（P＜0.3）则确定该基因的表达具有昼夜节律［21］。

表 1 荧光定量引物Tab. 1 The primers of qRT-PCR

2 结果

2.1 血清褪黑素水平变化

测定结果显示: 鳜血清中褪黑素的含量呈现出两极性的变化。光照开始时激素的含量为最高峰，在光照条件下（ZT0-ZT12）激素水平显著降低（P≤0.05）， 并在划定的黑暗阶段开始3h后（ZT15）水平降到最低点， 但在持续的黑暗环境中， 激素含量于（ZT15-ZT18）之间显著增高， 并在（ZT18-ZT24）保持恒定高水平（图 1）。

2.2 血清皮质醇水平变化

皮质醇在鳜血清中表现出的水平变化为: 在光周期阶段（ZT0-ZT12）直至黑暗阶段的第一个时间点（ZT15）基本保持缓慢下降趋势， 并在ZT15达到最低值， 随后在3h内（ZT15-ZT18）显著增加（P≤0.05）至最高值后， 继续保持缓慢下降的趋势（图 2）。

2.3 生物钟基因在鳜肝脏内的昼夜节律性表达

LD光制下的不同昼夜时点， 鳜各生物钟基因在肝脏内mRNA表达的统计分析结果为: Arntl1、Clock、Cry3、Cry-dash、Npas2、Npas4、Nr1d1、 Per1、Tim具有明显的时间差异显著性（P≤0.05）（图 3）。其中， 正向调节因子Arntl1 （P=0.50）、Clock（P=0.74）及Npas2 （P=0.57）虽然在各时间点上有显著性差异（P≤0.05）， 但在鳜肝脏中的表达无昼夜节律性（P≥0.3）， Npas4 （P=0.13）作为其同源基因， 呈现昼低夜高的节律性振荡， 达到峰值的时间为ZT22.84。在作为抑制因子的基因中， Cry-dash（P=0.05）的峰值相位在光照阶段（ZT5.46）， mRNA表达趋势为光周期先升高后降低， 暗周期先降低后升高， Per1 （P=0.06）的峰值相位为ZT1.83， 节律变化为昼低夜高， 而Cry3 （P=0.91）无节律性振荡（P≥0.3），Cry1a （P=0.18）与Per3 （P=0.25）则无表达的时间差异显著性（P＞0.05）。另一反馈环路中， Rora（P=0.29）也未在肝脏内表现出各时间点的差异显著性（P＞0.05）。Nr1d1 （P=0.25）峰值相位为ZT23.30，节律振荡趋势为昼低夜高， 但同一基因家族中的Nr1d2 （P=0.01）未表现出时间差异性（P＞0.05）。Tim （P=0.08）的mRNA表达的趋势为昼低夜高， 峰值相位为ZT22.54。著性差异（P≤0.05）， 但在鳜肝脏中的表达无昼夜节律性（P≥0.3）， Npas4 （P=0.13）作为其同源基因， 呈现昼低夜高的节律性振荡， 达到峰值的时间为ZT22.84。在作为抑制因子的基因中， Cry-dash（P=0.05）的峰值相位在光照阶段（ZT5.46）， mRNA表达趋势为光周期先升高后降低， 暗周期先降低后升高， Per1 （P=0.06）的峰值相位为ZT1.83， 节律变化为昼低夜高， 而Cry3 （P=0.91）无节律性振荡（P≥0.3），Cry1a （P=0.18）与Per3 （P=0.25）则无表达的时间差异显著性（P＞0.05）。另一反馈环路中， Rora（P=0.29）也未在肝脏内表现出各时间点的差异显著性（P＞0.05）。Nr1d1 （P=0.25）峰值相位为ZT23.30，节律振荡趋势为昼低夜高， 但同一基因家族中的Nr1d2 （P=0.01）未表现出时间差异性（P＞0.05）。Tim （P=0.08）的mRNA表达的趋势为昼低夜高， 峰值相位为ZT22.54。

图 1 LD光制下鳜血清中褪黑素的水平变化Fig. 1 Changes in the blood plasma Melatonin level of Siniperca chuatsi under LD light conditions

图 2 LD光制下鳜血清中皮质醇的水平变化Fig. 2 Changes in the blood plasma Cortisol level of Siniperca chuatsi under LD light conditions

图 3 LD光制下鳜肝脏生物钟基因mRNA昼夜节律性表达的时间模式Fig. 3 Temporal pattems of clock genes mRNA circadian expressions in the liver of Siniperca chuatsi under LD light conditions

2.4 生物钟基因在鳜心脏中的昼夜节律性表达

在一昼夜内的不同时点， 生物钟基因于鳜心脏内mRNA表达的结果显示: Arntl1、Clock、Cry1a、Npas2、Nr1d1、Nr1d2、Per3、Rora、Tim具有时间差异显著性（P≤0.05）（图 4）。在正向调节因子中，Arntl1 （P=0.00）的节律趋势为白天表达量降低， 夜间表达量升高， 其峰值相位为ZT21.70， Clock（P=0.29）的峰值相位为ZT21.89， 振荡趋势为昼低夜高， Npas2 （P=0.14）虽然也呈现出昼低夜高的振荡规律， 但其峰值相位为ZT18.22， 与Arntl1和Clock略有不同， 而Npas4 （P=0.12）在心脏中的表达没有显著的时间差异（P＞0.05）。在抑制因子中， Cry1a（P=0.13）则表现出另一种振荡趋势， 光照期先降低后升高， 黑暗期先升高后降低， 峰值相位为ZT18.45，Per3 （P=0.13）与Cry1a的表达规律相似， 峰值相位为ZT18.07， 但同为抑制因子的Cry3 （P=0.25）、Per1（P=0.01）无表达的时间差异性（P＞0.05）， Cry-dash（P=0.43）无节律性（P≥0.3）。Rora （P=0.04）位于另一反馈环路中， 在心脏内表现出了昼低夜高的节律变化， 峰值相位为ZT19.14。Nr1d1、Nr1d2虽为相同基因家族中的基因， 却呈现出不同的昼夜节律变化， Nr1d1的表达与抑制因子中基因的节律变化相近， 峰值相位为ZT20.06， Nr1d2却与正向调节因子中的Arntl1和Clock基因节律变化相似， 峰值相位为ZT22.08。Tim （P=0.05）的mRNA表达节律为白天降低夜晚升高， 峰值相位为ZT19.67。

3 讨论

昼夜节律参与了生物体所有的生理活动， 其重要作用越来越受到人们的广泛关注。而生物的生理节律是受一系列与节律相关基因构成的调控网络来进行调控的， 研究相应激素（褪黑素、皮质醇）与节律基因的时空表达模式对于了解生物钟系统的调控机制与作用规律至关重要。相关研究证明，褪黑素的合成及释放受光调节， 黑暗可刺激褪黑素合成及释放， 光线可抑制褪黑素合成及释放［2］。皮质醇浓度在睡眠阶段显著升高， 日间活动期间持续降低［22，23］。本研究对LD光制下鳜褪黑素和皮质醇的昼夜含量进行了测定， 结果显示: 鳜血清中褪黑素水平在光照阶段显著降低（P≤0.05）， 黑暗阶段显著上升； 皮质醇在早上含量高， 白天降低， 并在午夜显著升高至最高值后又开始持续降低。两种激素所测得的昼夜节律性与正常自然节律大致相同［22—24］，且最低值都出现在ZT15。由于LD光制是模拟自然条件来进行光照控制， 据此推测， 鳜的生理性暗周期可能在ZT15（21:00）开始， 而生理性光周期则可能在ZT0（06:00）开始， 对于这一观点还需进一步的研究论证。

昼夜节律参与生物体的新陈代谢、免疫调节等生命活动。在哺乳动物中， 敲除Clock基因会使小鼠表现出生物钟节律紊乱， 食欲增强， 过度肥胖，并容易形成高脂高糖血症［25］。在小鼠肝脏组织中，有100多个与代谢相关的基因表现出昼夜节律， 敲除Clock基因后的小鼠肝脏中这些基因的表达都出现不同程度的降低， 但在敲除Cry基因的小鼠肝脏中表达出现了升高［26］， 这进一步证明了肝脏代谢活动受生物钟基因的调控。Velarde等［21］对LD光制下Cry1、Cry2、Cry3、Per1、Per2、Per3在金鱼肝脏内的昼夜节律进行了研究， 得到的结果为: Cry1、Per1、Per2无明显的昼夜节律， Cry2的峰值在白天， Cry3的mRNA表达峰值在昼夜交替时出现，Per3的mRNA水平在半夜是最高的。在本研究结果中（表 2）， Cry1a、Cry3、Per3在鳜肝脏中无昼夜节律， Per1的mRNA表达在清晨最高， Clock、Arntl1、Npas2、Nr1d2、Rora在肝脏中无昼夜节律， Cry-dash的表达峰值位于中午， Nr1d1的最高峰值在凌晨， Npas4、Tim的峰值在黑暗阶段。相同生物钟基因在鳜与金鱼的肝脏中表达规律不一致表明生物钟基因在不同种类的鱼中表达的昼夜规律可能不一样。

图 4 LD光制下鳜心脏生物钟基因mRNA昼夜节律性表达的时间模式Fig. 4 Temporal pattems of clock genes mRNA circadian expressions in the heart of Siniperca chuatsi under LD light conditions

目前研究证明哺乳动物的心脏活动具有明显的昼夜节律［27］。在对人类的研究中， 多种心血管疾病的发生表现出了节律性， 如心肌梗塞、心肌缺血等疾病主要在早晨高发［28，29］。黄洁［30］对出生后小鼠心脏中的生物钟基因发育过程进行了研究， 在小鼠出生后的第3天观察到生物钟基因Arntl1、Cry1、Per2、Rev-erba开始在心脏中表达昼夜节律， 并且昼夜节律逐渐发展变化。Peirson等［31］研究发现， 在相同的环境下Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Arntl1在小鼠心脏和肝脏中的表达节律相似。据报道， 在斑马鱼心脏中Clock基因的mRNA表达水平在黑暗开始时出现最高峰［14］， 而生物钟基因在欧洲鲈心脏中的表达趋势则为: Per1的最高峰出现在清晨［32］， Cry1的表达峰值出现在上午［33］。在本研究中（表 3）， Clock在鳜心脏中的表达于深夜接近黎明时出现最高峰， Per1在鳜心脏中没有显示出昼夜节律， Cry1a的表达峰值在半夜出现， Arntl1和Nr1d2的mRNA最高峰位于黎明， Cry3、Cry-dash、Npas4无节律性， Per3、Npas2、Nr1d1、Rora、 Tim在心脏中的峰值相位出现在深夜。所得结果也与斑马鱼和欧洲鲈心脏中的生物钟基因节律不相同， 进一步表明了不同鱼类有着不同的生物钟基因表达规律。

表 2 鳜肝脏中生物钟基因mRNA表达的昼夜节律性参数Tab. 2 Circadian rhythmic parameters of clock genes mRNA expressions in the liver of Siniperca chuatsi

表 3 鳜心脏中生物钟基因mRNA表达的昼夜节律性参数Tab. 3 Circadian rhythmic parameters of clock genes mRNA expressions in the heart of Siniperca chuatsi

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在长期的进化过程中， 每种生物都形成了自身的昼夜节律， 现在关于这方面的研究还处于种属水平的资料累积阶段。目前还没有关于鳜昼夜节律方面的报道。本研究结果对鳜褪黑素、皮质醇和13个生物钟基因的昼夜变化规律进行了初步的研究分析， 为鱼类生物钟调节机制的进一步研究和鱼类生理学的研究提供一定价值的基础资料。

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CIRCADIAN RHYTHMICITY OF CLOCK GENES IN LIVER AND HEART OF MANDARIN FISH （SINIPERCA CHUATSI）

YAN Hui-Ling1，2， CHU Wu-Ying2， WU Ping2，3， WANG Jian-Hua2，4， LIU Xiao-Yan1and ZHANG Jian-She2
（1. College of Animal Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China； 2. Department of Bioengineering and Environmental Science， Changsha University， Changsha 410003， China； 3. College of Biology， Hunan University，Changsha 410082， China； 4. College of Life Science， Guangxi Normal University， Guilin 541004， China）

Clock genes are the molecular core of circadian rhythm of vertebrates. In the present study， we investigated the expression of clock genes which contained Arntl1， Clock， Cry1a， Cry3， Cry-dash， Npas2， Npas4， Nr1d1， Nr1d2，Per1， Per3， Rora and Tim in liver and heart of Mandarin fish （Siniperca chuatsi） under the 12h-light and 12h-dark （LD）cycle condition. Melatonin and cortisol levels were also investigated under the same condition. Livers， hearts and plasma of Mandarin fish were collected at ZT0（06:00）， ZT3（09:00）， ZT6（12:00）， ZT9（15:00）， ZT12（18:00），ZT15（21:00）， ZT18（24:00）， ZT21（03:00， 2ndday）， ZT24（06:00， 2ndday） （Zone time， ZT） with three fishes at each time point. The total mRNA was extracted from each sample， the semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （qRT-PCR） was used to determine the temporal changes in mRNA levels. Blood plasma melatonin and cortisol were quantified by competitive ELISA. The data were analyzed both by the One-Way ANOVA （SPSS 17.0） and the cosine function （Matlab 7.0） to investigate the circadian rhythm of these genes. The result indicated that: Cry-dash，Npas4， Nr1d1， Per1 and Tim displayed daily rhythmic expression in the liver. Except for Cry-dash， the expression of the other genes decreased during the light phase and increased in the dark phase. In addition， there were two rhythmic characters of the 9 genes which contained Arntl1， Clock， Cry1a， Npas2， Nr1d1， Nr1d2， Per3， Rora and Tim in the heart of Mandarin fish: 3 genes including Arntl1， Clock and Nr1d2 were reduced at light but increased at dark phase and the mRNA levels of the others sustained low in ZT0 （06:00）-ZT15 （21:00）， while increased significantly in ZT15 （21:00）-ZT18 （24:00） and then decreased in ZT18 （24:00）-ZT21 （03:00）. Plasma melatonin levels showed a biphasic diurnal pattern， with higher concentrations during the dark phase than the light phase， its lowest level was observed at ZT15（21:00）. Changes in the serum cortisol levels exhibited circadian pattern over a 24h period that the peak detected at ZT18 （24:00） and the trough detected at ZT15 （21:00）. In summary， most of the clock genes were expressed in a circadian manner in liver and heart of Mandarin fish （Siniperca chuatsi）， with differences in phase and amplitude.

Mandarin fish （Siniperca chuatsi）； Circadian rhythm； Clock gene； Melatonin； Cortisol

10.7541/2016.34

Q344+.1

A

1000-3207（2016）02-0243-09

2015-05-05；

2015-10-06

国家自然科学基金项目（31472256， 31230076）； 湖南省自然科学基金项目（14JJ2135）资助 ［Supported by the National Natural

鄢慧玲（1990—）， 女， 湖南常德人； 硕士； 研究方向为水生生物学。E-mail:yanhuiling90@163.com

刘小燕（1965—）， 女， 湖南益阳人； 博士， 教授； 研究方向为水产动物医学。E-mail:liuxy186@163.com；

褚武英（1971—）， 男， 江西南昌人； 博士， 教授； 研究方向鱼类肌肉分化调控。E-mail: 2621372124@qq.com