雷公藤多苷对糖尿病肾病大鼠核因子-κB信号通路的影响

杨薇 李春君 孙蓓 厉莉 王珊珊 郭欣 张晓娜 马泽军 陈莉明

·论著·

雷公藤多苷对糖尿病肾病大鼠核因子-κB信号通路的影响

杨薇 李春君 孙蓓 厉莉 王珊珊 郭欣 张晓娜 马泽军 陈莉明

目的探讨不同剂量雷公藤多苷(TWP)对糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织核因子-κB信号通路的影响。方法选取60只Sprague-Dawley(SD)大鼠，给予高糖、高脂饮食联合尾静脉注射链脲佐菌素(30 mg/kg)建立DN大鼠模型。将成模大鼠按照随机数字表法分为DN对照组(DNC组，n=8)、低剂量TWP治疗组(3 mg·kg-1·d-1，n=8)、中剂量TWP治疗组(6 mg·kg-1·d-1，n=8)、高剂量TWP治疗组(9 mg·kg-1·d-1，n=10)。选取10只大鼠作为正常对照组(NC组)，喂养常规饲料，灌胃8周后检测大鼠的体重、肾重体重比、尿微量白蛋白、血糖、肝功能、肾功能，并采用HE染色观察肾脏形态改变，分别采用免疫组化法、q-PCR法、Western印迹方法对大鼠肾脏核因子-κB、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)以及白细胞介素-6(IL-6)进行定位定量分析(以观察不同剂量TWP对大鼠肾脏核因子-κB、ICAM-1、IL-6表达的影响)。结果TWP治疗可减少尿白蛋白，但对体重、血糖、肝功能、肾功能无影响，可降低DN大鼠肾脏核因子-κB、ICAM-1、IL-6 mRNA(t核因子-κB=8.89～16.88，tICAM-1=9.56～15.92，tIL-6=10.16～25.78，P均<0.05及蛋白(t核因子-κB=9.87～17.38，tICAM-1=8.54～16.95，tIL-6=9.76～20.18，P均<0.05)表达，且呈剂量依赖性，中高剂量TWP抑制更明显(P均<0.05)。结论TWP呈剂量依懒性抑制DN大鼠肾组织核因子-κB炎性反应信号通路。

雷公藤多苷；糖尿病肾病；核因子-κB；细胞间黏附分子-1；白细胞介素-6

糖尿肾病(DN)是糖尿病患者的微血管并发症之一，是由多种因素相互作用所引起的一种低度炎性疾病[1]。大量研究证实，炎性反应因子对DN的发生、发展发挥重要作用[2]。其中核因子-κB信号通路是介导慢性炎性反应的经典通路，核因子-κB是细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和白细胞介素-6(IL-6)的上游因子[3]。同时ICAM-1、IL-6可加速DN进展，因此抑制核因子-κB信号通路可以延缓DN的进展，提示核因子-κB有可能成为DN的治疗位点[4]。雷公藤多苷(TWP)是一种植物免疫抑制剂，能够抑制多种炎性反应信号通路，具有独特的抗炎、抗免疫作用[5]。本研究以DN大鼠为研究对象，旨在观察不同剂量TWP对肾组织核因子-κB、ICAM-1、IL-6 mRNA和蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂与仪器：(1)链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)。(2)TWP片(浙江得恩德制药公司)。(3)抗核因子-κB、ICAM-1、IL-6单克隆抗体(美国Abcam公司)，抗GAPDH抗体(天津三箭生物技术有限公司)。(4)SYBR q-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，cDNA逆转录试剂盒(Thermo公司)。(5)凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司)。(6)实时荧光定量PCR仪(日本Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物造模及分组 6周龄清洁级雄性Spraugue-Dawley(SD)大鼠70只，体质量(161±9)g，予常规饲料适应性喂养1周后，按随机数字表法进行分组，随机选取10只大鼠作为正常对照组(NC组)，继续喂养常规饲料，其余60只作为DN模型组给予高糖、高脂饲料(具体配方为：蔗糖10%，猪油10%，胆固醇1%，胆酸钠0.3%)。喂养8周后，高糖、高脂饲料组大鼠尾静脉注射STZ 30 mg/kg，NC组予以尾静脉注射等体积柠檬酸缓冲液[6]。共成模56只，将成模大鼠按随机数字表法分为DN对照组(DNC组)、低剂量TWP治疗组(3 mg·kg-1·d-1)、中剂量TWP治疗组(6 mg·kg-1·d-1)、高剂量TWP治疗组(9 mg·kg-1·d-1)。不同剂量TWP治疗组灌胃给药，而NC组和DNC组分别灌胃等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液灌胃8周后，成模大鼠共死亡22只。最终每组只数分别为：NC组10只，DNC组8只，低剂量TWP治疗组8只，中剂量TWP治疗组8只，高剂量TWP治疗组10只。

1.2.2 标本收集与处理 在灌胃8周后测定各组大鼠的体重、随机血糖，股动脉取血用于检测肝、肾功能，收集每只大鼠24 h尿液(将大鼠置于代谢笼内，每笼6～8只)，用于检测尿微量白蛋白。

1.2.3 肾脏组织病理学 灌胃第8周末处死大鼠后，分别取出两肾，以冰PBS灌注冲洗干净，滤纸吸除多余水分。右肾于称重后置于4%多聚甲醛固定，取少量肾组织，常规制片，进行HE染色。

1.2.4 免疫组化检测核因子-κB表达 将肾组织切片置于60℃恒温箱中烘烤20～30 min，取出后静置5 min，然后依次将载玻片放入二甲苯Ⅰ及不同浓度酒精中脱蜡，脱蜡后进行抗原修复，然后滴加核因子-κB抗体(1∶100)，滴加二氨基联苯胺反应底物显色，苏木素复染，浸泡、脱水、封片。

1.2.5 q-PCR法检测核因子-κB、ICAM-1、IL-6的mRNA表达 Trizol法提取大鼠肾组织总RNA，取2 μg RNA进行反转录合成cDNA，反应体系包括：4.0 μl RT Buffer(5×)，1.0 μl RiboLock RNase Inhibitor，2.0 μl 10 mmol/L dNTP Mix，1.0 μl RevertAid Reverse Transcriptase，1.0 μl Oligo(dT)18 Primer，RNA sample 和 ddH2O。 PCR扩增目的基因，扩增时反应体系包括：5 μl 2×SYBR®Premix Ex TaqTM，0.5 μl 上游引物(10 μmol/L)及0.5 μl下游引物(10 μmol/L)，1 μl DNA模板，3 μl H2O。反应条件：95℃ 5 min预变性；95℃ 15 s变性，60℃ 40 s退火并延伸；循环40次。目的片段引物用Oligo 6.0软件设计(表1)，由北京奥科生物技术公司合成。用凝胶图像系统成像及进行扫描定量分析，以所测得净光密度与内参照净光密度的比值代表半定量值，进行统计分析。

1.2.6 Western印迹法检测核因子-κB、ICAM-1、IL-6的蛋白表达 RIPA裂解液裂解大鼠肾组织，离心提取上清液，40 μg蛋白上样于12%聚丙烯酰胺凝胶，电泳后转膜于0.45 μm PVDF膜。封闭2 h，加入特异性一抗(GAPDH 1∶10 000、核因子-κB 1∶1 000、ICAM-1 1∶500、IL-6 1∶1 000)4℃孵育过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的抗兔或抗小鼠IgG(1∶10 000)室温孵育1 h。最后用ECL化学发光剂染色、显影。以凝胶成像系统记录观察结果，采用2Del凝胶分析软件对电泳结果进行扫描，将核因子-κB、ICAM-1、IL-6条带与GAPDH条带灰度值比值表示各指标的蛋白相对表达量。

表1 各目的基因的引物序列及扩增长度

注：IL-6：白细胞介素-6；ICAM-1：细胞间黏附分子-1

2 结果

2.1 一般指标变化 与NC组相比，DNC组血糖及尿微量白蛋白水平升高，体重降低(P均<0.05)；与DNC组相比，各剂量TWP治疗组血糖、体重差异均无统计学意义(P均>0.05)，而尿微量白蛋白明显减少(P<0.05)，且中、高剂量TWP治疗组较低剂量TWP治疗组减少更明显，呈剂量依赖性。各组肝、肾功能比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.2 肾组织HE染色结果 光镜下观察，NC组肾小球形态规则，无明显肾小球基底膜增厚及其他明显病变(图1A，封3)；DNC组可见肾小球体积略增大，肾小球基底膜明显增厚、系膜基质增生，部分肾小球内皮细胞呈空泡变性(图1B，封3)。而经TWP治疗后的肾小球上述病理改变有不同程度改善，而且中、高剂量TWP治疗组改善更加明显，图1C～E(封3)。

注：A为正常对照组：肾小球形态规则，无明显肾小球基底膜增厚；B为糖尿病肾病对照组：肾小球体积略增大，炎性细胞浸润明显，肾小球基底膜明显增厚、系膜基质增生，部分肾小球内皮细胞呈空泡变性；C为低剂量雷公藤多苷治疗组：肾小球基底膜增厚减轻，炎细胞浸润减少；D为中剂量雷公藤多苷治疗组：肾小球形态基本规则，炎细胞浸润减少，系膜基质增生缓解；E为高剂量雷公藤多苷治疗组：肾小球形态接近正常对照组，基底膜增厚不明显，炎细胞浸润明显减少图1 肾组织HE染色实验结果(400×)

2.3 肾组织免疫组化结果 免疫组化检测结果显示，NC组肾组织各部位少量核因子-κB表达(图2A，封3)；DNC组肾小球大量表达核因子-κB(图2B，封3)；而在不同剂量TWP治疗组肾小球表达核因子-κB逐渐减少(图2C～E，封3)。图像分析结果显示，DNC组核因子-κB表达增加，与NC组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；不同剂量TWP治疗组核因子-κB表达明显减少，与DNC组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，中高剂量TWP治疗组表达明显减少，与低剂量TWP治疗组相比差异有统计学意义(P<0.05)，图2F(封3)，图3。

注：A为正常对照组：肾组织各部位无或少量核因子-κB表达，特异性染色颜色最浅；B为糖尿病肾病对照组：核因子-κB在肾小球大量表达,特异性染色颜色最深；C、D、E为低、中、高剂量雷公藤多苷治疗组：肾组织核因子-κB表达逐渐减少，特异性染色颜色逐渐变浅图2 肾组织核因子-κB免疫组化结果(400×)

注：NC组：正常对照组；DNC组：糖尿病肾病对照组；L-TWP组：低剂量雷公藤多苷治疗组；M-TWP组：中剂量雷公藤多苷治疗组；H-TWP组：高剂量雷公藤多苷治疗组；NF-κB：核因子-κB；TPA：平均面积密度；与NC组相比，aP<0.05；与DNC组相比，bP<0.05；与L-TWP组相比，cP<0.05图3 免疫组化法对各组肾组织核因子-κB半定量分析

组别例数体重(g)KW/BW(mg/g)UMA(μg/24h)血糖(mmol/L)BUN(mmol/L)SCr(μmmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)NC组10442.7±43.83.2±0.245.7±14.56.0±0.210.9±2.032.8±4.449.7±9.5105.1±18.4DNC组8298.6±37.1a5.8±0.5a253.7±53.0a28.2±3.0a10.7±1.631.3±3.355.1±5.1109.4±8.4L-TWP组8318.2±22.1a5.0±0.5a183.5±78.7ab25.8±6.9a10.9±1.332.8±3.553.8±10.9116.8±9.5M-TWP组8308.6±37.8a5.1±0.3a123.8±74.8abc27.6±5.7a10.0±1.931.1±4.154.9±9.799.5±15.9H-TWP组10328.5±6.8a4.6±0.8a119.0±52.0abc29.0±3.1a10.2±1.231.5±3.854.2±8.9112.2±13.9F值112.322.14102.2815.7610.3430.1053.60102.10P值<0.05<0.05<0.05<0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

注：NC组：正常对照组；DNC组：糖尿病肾病对照组；L-TWP组：低剂量雷公藤多苷治疗组；M-TWP组：中剂量雷公藤多苷治疗组；H-TWP组：高剂量雷公藤多苷治疗组；KW/BW:肾重体重比；UMA:尿微量白蛋白；BUN：血尿素氮；SCr：血肌酐；ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶；与NC组对比，aP<0.05；与DNC组对比，bP<0.05；与L-TWP组相比，cP<0.05

2.4 肾脏核因子-κB、ICAM-1、IL-6 mRNA的表达 DNC组核因子-κB、ICAM-1、IL-6 mRNA表达量明显升高，与NC组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，TWP治疗组较DNC组有较大幅度降低(P<0.05)，各治疗组间，中、高剂量TWP治疗组较低剂量TWP治疗组有较大幅度降低(P<0.05)，见图4。

2.5 肾脏核因子-κB、ICAM-1、IL-6的蛋白表达 Western印迹结果显示，DNC组核因子-κB、ICAM-1、IL-6的蛋白表达量明显升高，与NC组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，TWP治疗组较DNC组有较大幅度降低(P<0.05)，中、高剂量TWP治疗组较低剂量TWP治疗组有较大幅度降低(P<0.05)，见图5。

3 讨论

炎性反应及炎性因子对促进DN的发生、发展发挥不可或缺的作用。有研究表明通过抑制核因子-κB炎性反应信号通路可延缓DN进展，提示核因子-κB是治疗DN的重要靶点[7]。研究已证实，在STZ诱导的糖尿病大鼠肾组织中，核因子-κB表达量明显增加，且与尿白蛋白水平呈正相关。人体研究亦发现，DN患者核因子-κB信号通路的活性高于无肾病的糖尿病患者，而且与尿白蛋白程度密切相关[8]。核因子-κB信号通路被激活后可调节促炎因子、黏附分子和趋化因子的基因表达[9]。ICAM-1和IL-6是核因子-κB的下游因子。

注：NC组：正常对照组；DNC组：糖尿病肾病对照组；L-TWP组：低剂量雷公藤多苷治疗组；M-TWP组：中剂量雷公藤多苷治疗组；H-TWP组：高剂量雷公藤多苷治疗组；NF-κB：核因子-κB；ICAM-1：细胞间黏附分子-1；IL-6：白细胞介素-6；与NC组相比，aP<0.05；与DNC组相比，bP<0.05；与L-TWP组相比，cP<0.05图4 PCR法检测各组肾组织中核因子-κB、ICAM-1、IL-6mRNA相对表达量

注：NC组：正常对照组；DNC组：糖尿病肾病对照组；L-TWP组：低剂量雷公藤多苷治疗组；M-TWP组：中剂量雷公藤多苷治疗组；H-TWP组：高剂量雷公藤多苷治疗组；NF-κB：核因子-κB；ICAM-1：细胞间黏附分子-1；IL-6：白细胞介素-6；与NC组相比，aP<0.05；与DNC组相比，bP<0.05；与L-TWP组相比，cP<0.05图5 Western印迹检测各组肾组织中核因子-κB、ICAM-1、IL-6蛋白的相对表达量

ICAM-1是细胞黏附分子免疫球蛋白家族中的重要成员，通过受体与配体结合，介导细胞之间，细胞和基质之间的黏附作用，是细胞浸润、细胞增殖、细胞外基质扩张及肾小球硬化的分子生物学基础[10]。而IL-6可促进糖尿病时肾小球纤维化的发生、发展。与既往的研究结果一致，本研究实验结果表明核因子-κB在NC组无或少量表达，而DNC组核因子-κB、ICAM-1、IL-6 mRNA及蛋白表达量明显增加，提示核因子-κB、ICAM-1、IL-6参与了DN的发生及发展过程。

TWP是卫矛科雷公藤植物的根，含少量二萜类及生物碱成分，具有抗炎、缓解肾脏系膜细胞及基质增生，改善电荷屏障等作用[11]。本研究发现DNC组尿白蛋白增多的同时伴随炎性因子核因子-κB、ICAM-1、IL-6升高，而经TWP治疗后，各治疗组白蛋白尿减少的同时伴随核因子-κB、ICAM-1、IL-6降低，首次证实TWP通过抑制核因子-κB信号通路来延缓DN进展。

TWP抑制免疫作用表现为抑制细胞免疫和体液免疫[5]。本研究同样发现不同剂量TWP治疗组能够呈剂量依赖性降低核因子-κB、ICAM-1、IL-6水平，尤其在中、高剂量组作用更明显。然而，由于TWP剂量过大所致的肝、肾毒性，使其临床应用一直存在争议，孔岩等[12]已证实，当TWP剂量达到24 mg·kg-1·d-1时，可导致肾毒性。而本研究最高剂量为9 mg·kg-1·d-1，所以大鼠肝、肾功能未出现异常，本实验最后造模成功率为93.3%，大多数是在STZ注射1周内死亡，笔者将死亡大鼠进行尸检并抽取大鼠血液，并未发现肝、肾结构及功能的异常，考虑可能由于饲养时正值夏季酷暑，饲养室潮湿闷热，加之大鼠饮食不规律，免疫力低下，STZ注射后的二次创伤导致死亡。

本实验表明TWP能抑制DN大鼠肾组织核因子-κB信号通路，从而下调ICAM-1和IL-6表达，减少白蛋白尿，表明TWP通过抑制核因子-κB信号通路发挥对DN大鼠肾脏的保护作用。然而，本课题只进行了动物研究，还需体外实验，进一步探究核因子-κB信号通路在DN进展中的作用机制。

[1] Navarro-González JF, Mora-Fernández C, Muros de Fuentes M,et al. Inflammatory molecules and pathways in the pathogenesis of diabetic nephropathy[J].Nat Rev Nephrol, 2011,7(6):327-340.DOI: 10.1038/nrneph.2011.51.

[2] Fornoni A, Ijaz A, Tejada T, et al. Role of inflammation in diabetic nephropathy[J].Curr Diabetes Rev,2008,4(1):10-17.

[3] Chen Y, Sun T, Wu J, et al. Icariin intervenes in cardiac inflammaging through upregulation of SIRT6 enzyme activity and inhibition of the NF-kappa B pathway[J]. Biomed Res Int,2015,2015:895976.DOI: 10.1155/2015/895976.

[4] Fang Q, Zhao L, Wang Y, et al. A novel chalcone derivative attenuates the diabetes-induced renal injury via inhibition of high glucose-mediated inflammatory response and macrophage infiltration[J].Toxicol Appl Pharmacol,2015, 282(2):129-138.DOI: 10.1016/j.taap.2014.10.021.

[5] 刘国玲，沈永杰，尤丽菊等. 雷公藤多苷降低糖尿病肾病大鼠炎性细胞因子的表达[J].细胞与分子免疫学杂志，2014,30(7):721-724.

[6] Li D, Lu Z, Jia J,et al. MiR-124 is related to podocytic adhesive capacity damage in STZ-induced uninephrectomized diabetic rats[J].Kidney Blood Press Res, 2013,37(4-5):422-431.DOI: 10.1159/000355721.

[7] Wada J, Makino H. Inflammation and the pathogenesis of diabetic nephropathy[J].Clin Sci (Lond),2013,124(3):139-152. DOI: 10.1042/CS20120198.

[8] Hofmann MA, Schiekofer S, Isermann B, et al. Peripheral blood mononuclear cells isolated from patients with diabetic nephropathy show increased activation of the oxidative-stress sensitive transcription factor NF-kappaB[J].Diabetologia,1999, 42(2):222-232.

[9] Soetikno V, Sari FR, Veeraveedu PT,et al. Curcumin ameliorates macrophage infiltration by inhibiting NF-κB activation and proinflammatory cytokines in streptozotocin induced-diabetic nephropathy[J].Nutr Metab (Lond),2011,8(1):35. DOI: 10.1186/1743-7075-8-35.

[10] Chang CZ, Wu SC, Lin CL,et al. Valproic acid attenuates intercellular adhesion molecule-1 and E-selectin through a chemokine ligand 5 dependent mechanism and subarachnoid hemorrhage induced vasospasm in a rat model[J].J Inflamm (Lond),2015,12:27.DOI: 10.1186/s12950-015-0074-3. eCollection 2015.

[11] 赵晨光，于为民，任小军，等. 雷公藤多苷对糖尿病肾病大鼠肾小管间质激活素A表达及转分化的影响[J]. 中华医学杂志,2014,18(94):1427-1432.DOI:10.37601/cma.j.issn.0376-2491.2014.18.019.

[12] 孔岩，单春艳，常宝成，等. 雷公藤多甙对糖尿病肾病大鼠肾脏肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4表达和尿微量白蛋白的影响[J]. 中华糖尿病杂志,2013,5(9):541-546.DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-5809.2013.09.006.

Effectsoftriperygiumwilfordiipolyglucosideonnuclearfactor-κBsignalingpathwayinratswithdiabeticnephropathy

YangWei*,LiChunjun,SunBei,LiLi,WangShanshan,GuoXin,ZhangXiaona,MaZejun,ChenLiming.

*TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China

Correspondingauthor：ChenLiming，Email：xfx22081@vip.163.com

ObjectiveTo investigate the effects of different doses of triperygium wilfordii polyglucoside (TWP) on the nuclear factor-κB signaling pathway in rats with diabetic nephropathy (DN).MethodsA total of 60 Sprague-Dawley (SD) rats were seleted. DN rats model were established by high-glucose and high fat diet, in combination with streptozotocin injection from tail vein. DN rats were divided into diabetic normal control group (DNC group,n=8), low dose of TWP group(L-TWP group，3 mg·kg-1·d-1,n=8) group, median dose of TWP group(M-TWP group，6 mg·kg-1·d-1,n=8), and high dose of TWP group (H-TWP group，9 mg·kg-1·d-1,n=10) according to the random number table method. Ten healthy rats were used as control group. After 8 weeks of intervention, body weight(BW), kidney weight/body weight(KW/BW), urine microalbumin(UMA), blood glucose, liver function and renal function were examined. HE staining was used to observe the changes of kidney morphology. Immunohistochemical method, q-PCR and Western blotting were used to analyze the location and expression level of nuclear factor-κB, intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) and interleukin-6(IL-6). The effects of different doses of TWP on the expression of nuclear factor-κB, ICAM-1 and IL-6 in rats with DN.ResultsTWP therapy decreased UMA but did not affect BW, KW/BW, liver function and renal function. TWP also down-regulated the expression of nuclear factor-κB,ICAM-1,IL-6 mRNA (tNuclear factor-κB=8.89-16.88,tICAM-1=9.56-11.67,tIL-6=10.16-25.78, allP<0.05) as well as the protein level (tNuclear factor-κB=9.87-17.38,tICAM-1=8.54-16.95,tIL-6=9.76-20.18, allP<0.05) in dose-dependent manner; the effects were robust in L-TWP and H-TWP group (allP<0.05).ConclusionTWP suppresses inflammatory signaling pathways of nuclear factor-κB in a dose-dependent manner.

Triperygium wilfordii polyglucoside；Diabetic nephropathy; Nuclear factor-κB；Intercellular adhesion molecule-1；Interleukin-6

国家自然科学基金资助项目(81273915)；天津市自然科学基金资助项目(14JCYBJC26200)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.02.008

300070 天津医科大学(杨薇)；300070 天津医科大学代谢病医院糖尿病肾病科，卫生部激素与发

育重点实验室(李春君，孙蓓，厉莉，王珊珊，郭欣，张晓娜，马泽军，陈莉明)

陈莉明，Email:xfx22081@vip.163.com

FundprogramNational Natural Science Foundation(81273915); Natural Science Foundation of Tianjin(14JCYBJC26200)

2016-07-09)