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七叶皂苷钠抑制人甲状腺未分化癌HTh74细胞株增殖作用的研究

2016-11-24李兴佳郑全喜陈国芳茅晓东刘超

国际内分泌代谢杂志 2016年2期
关键词:皂苷钠细胞株激酶

李兴佳 郑全喜 陈国芳 茅晓东 刘超

·论著·

七叶皂苷钠抑制人甲状腺未分化癌HTh74细胞株增殖作用的研究

李兴佳 郑全喜 陈国芳 茅晓东 刘超

目的研究七叶皂苷钠对人甲状腺未分化癌HTh74细胞株增殖的潜在抑制作用及其分子机制。方法以不同浓度的七叶皂苷钠(0,20,40,60,80 μmol/L)处理HTh74细胞48 h后,观察细胞形态变化;以不同浓度的七叶皂苷钠(0,20,40,60,80 μmol/L)处理HTh74细胞24 h、48 h和72 h后,噻唑蓝比色(MTT)法检测七叶皂苷钠对HTh74细胞株增殖的抑制效应并计算细胞增殖率及半数抑制率(IC50);以不同浓度的七叶皂苷钠(0,5,10,15,20,25 μmol/L)处理HTh74细胞48 h后,Western印迹检测七叶皂苷钠引起的蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)以及细胞周期相关蛋白的表达。结果七叶皂苷钠作用后,细胞发生明显皱缩,且作用浓度越高细胞皱缩越明显;MTT法结果显示,七叶皂苷钠对HTh74细胞有显著的生长抑制作用,呈现典型的时间与剂量依赖性,80 μmol/L七叶皂苷钠作用24 h,对细胞的生长抑制作用有统计学意义(F=111.4,P<0.01),而40 μmol/L作用48 h及72 h时, 细胞生长均受到抑制(F=543.6,722.1,P<0.01),并且48 h的IC50为69.4 μmol/L,72 h的IC50为32.5 μmol/L;七叶皂苷钠作用48 h后Akt、p-Akt和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)2的表达显著降低,并呈现剂量依赖效应。与未经处理的细胞相比,低浓度(5 μmol/L和10 μmol/L)七叶皂苷钠处理时Akt和p-Akt的表达水平已开始降低(F=613.9,P<0.05),而从15 μmol/L开始,CDK2表达的降低有统计学意义(F=208.9,208.3,P<0.05)。CDK1、CDK6、细胞周期蛋白D以及细胞周期蛋白E的表达在各处理组间差异无统计学意义(P均>0.05)。结论七叶皂苷钠可抑制人甲状腺未分化癌HTh74细胞的增殖,可能是通过调节Akt、p-Akt以及CDK2等蛋白的表达实现的。

甲状腺未分化癌;HTh74;七叶皂苷钠;细胞周期;细胞凋亡

甲状腺癌在病理学上共分为4种,分别是甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡状癌、甲状腺髓样癌和甲状腺未分化癌,其中甲状腺未分化癌的恶性程度最高、预后最差[1]。目前,临床上针对分化型甲状腺癌治疗的手段主要为手术联合放射性碘清扫;而对未分化癌的治疗一直没有非常有效的手段,未分化癌对放射性碘的治疗不敏感,手术、化学治疗效果也不尽如人意。因此,从中草药中寻找甲状腺未分化癌敏感的新化合物成为该领域的重要研究方向。

临床上广泛应用的药物七叶皂苷钠,为七叶皂苷的钠盐化合物。七叶皂苷是从七叶树的果实和干燥成熟种子(总称婆罗子)中提取得到的总皂苷,属于五环三菇皂苷,具有抗渗出、增加静脉张力、消肿、抗炎和改善血液循环的作用[2-4]。临床上常用其钠盐作为抗炎和抗水肿药物。与其他五环三菇皂苷类化合物相比,国内、外对七叶皂苷的研究还处于初步阶段,特别是有关其抑制肿瘤细胞增殖的分子机制研究比较匮乏[5]。因此,本研究采用人甲状腺未分化癌HTh74作为研究对象,探讨七叶皂苷钠抑制肿瘤细胞增殖的作用机制,为中药治疗甲状腺未分化癌提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人甲状腺未分化癌HTh74细胞株由德国Charite医学院Derwahl教授赠送。

1.1.2 药物 七叶皂苷钠购于南京艾斯替么中药研究所,室温干燥保存。七叶皂苷钠用DMEM溶解配制成20 mmol/L的贮存液,-20℃冰箱保存。

1.1.3 试剂 RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素购于美国Invitrogen公司。噻唑蓝为美国Sigma公司产品。蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt),细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)1、CDK2、CDK6、细胞周期蛋白(cyclin)D和cyclinE的一抗为美国Bioworld公司产品,GAPDH一抗购于南京康成生物公司。羊抗鼠-HRP标记二抗、羊抗兔-HRP标记二抗购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及干预条件 人甲状腺未分化癌HTh74细胞株在37℃、5%CO2条件下,用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的F-12培养基传代培养。取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞形态观察 不同浓度的七叶皂苷钠(0,20,40,60,80 μmol/L)处理处于对数生长期的HTh74细胞,于48 h后观察细胞的形态变化,倒置显微镜拍摄(200×)。

1.2.3 细胞增殖分析 噻唑蓝比色法分析七叶皂苷钠对HTh74细胞增殖的抑制作用。取对数生长期的HTh74细胞接种于96孔板中,接种密度为5×103个/孔,每组设置3个复孔。去血清饥饿过夜后,分别加入含不同浓度七叶皂苷钠(0,20,40,60,80 μmol/L)的完全培养液,继续培养24、48及72 h。培养结束后,每孔加入5 mg/ml的噻唑蓝10 μl,37℃温育4 h。吸除上清液,每孔加入100 μl二甲基亚砜,室温震荡溶解结晶10 min,于570 nm(吸收波长)和630 nm(参比波长)测吸光光度值。计算细胞增殖率及半数抑制率(IC50)。细胞增殖率=实验组(A570nm-A630nm)/对照组(A570nm-A630nm)×100%。

1.2.4 Western印迹分析 对数生长期的HTh74细胞去血清饥饿12 h后,用不同浓度的七叶皂苷钠(0,5,10,15,20,25 μmol/L)处理48 h,冰上裂解细胞提取总蛋白,Nanodrop 1000检测蛋白浓度,用浓度为10%的SDS-PAGE凝胶进行电泳,上样量为30 μg,湿转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h,一抗孵育过夜,二抗孵育1 h后,ECL显影曝光。Quantity one软件对蛋白条带进行灰度分析,以GAPDH为内参,比较经不同浓度七叶皂苷钠处理后,Akt、p-Akt,cyclinD、cyclinE以及CDK1、CDK2和CDK6表达水平的变化。

2 结果

2.1 七叶皂苷钠对HTh74细胞形态的影响 光学显微镜下观察到七叶皂苷钠处理后细胞形态发生明显变化。20 μmol/L七叶皂苷钠处理48 h后,细胞开始发生皱缩,并且有部分细胞脱离培养皿;随着七叶皂苷钠处理浓度的增加,细胞的皱缩程度越来越严重,脱离培养皿的细胞数也逐渐增加,80 μmol/L时细胞已皱缩至圆形,几乎无贴壁(图1)。

2.2 七叶皂苷钠对HTh74细胞增殖的作用 噻唑蓝比色法分析显示,七叶皂苷钠呈浓度、时间依赖性抑制HTh74细胞的增殖(图2)。80 μmol/L七叶皂苷钠作用24 h,对细胞的生长抑制作用有统计学意义(F=111.4,P<0.01),而40 μmol/L作用48 h及72 h时, 细胞生长均受到抑制(F=543.6,722.1,P均<0.01),并且48 h、72 h的IC50分别为69.4 μmol/L和 32.5 μmol/L。

图1 七叶皂苷钠对HTh74细胞形态的影响(莱卡倒置显微镜,200×)

注:与对照组相比,aP<0.01图2 七叶皂苷钠对HTh74细胞增殖的抑制作用

2.3 七叶皂苷钠对HTh74细胞Akt、p-Akt及cyclin表达的影响 七叶皂苷钠处理HTh74细胞48 h后,Akt、p-Akt以及CDK2的表达水平均明显降低,并呈现剂量依赖效应,与未经处理的细胞相比,低浓度(5 μmol/L和10 μmol/L)七叶皂苷钠处理时Akt和p-Akt的表达水平已开始降低(P均<0.05),而从15 μmol/L开始,CDK2表达的降低有统计学意义(P均<0.01);而CDK1、CDK6、cyclinD和cyclinE的表达在各处理组间差异无统计学意义(图3)。

3 讨论

七叶皂苷是从婆罗子中提取得到的总皂苷。国内、外对七叶皂苷的研究比较广泛,但有关其抗肿瘤活性的报道较少。1986年Konoshima和Lee[6]首次报道七叶树果实中的皂苷可抑制鼻咽癌KB细胞的增殖,半数有效量(ED50)为3.6 g/ml。近5年的研究表明,七叶皂苷钠在体外对人鼻咽癌KB细胞、人宫颈癌Hela细胞、人胃癌SGC-7901细胞、人白血病HL-60细胞、小鼠白血病P388细胞及3种人结肠癌HeT-8、HT-29、HeT-116细胞均有生长抑制作用[7-13]。体内研究也发现其能够抑制小鼠宫颈癌U14、肝癌H22、肉瘤S180和白血病P388细胞生长[7-10]。此外,还有研究发现七叶皂苷钠可降低大鼠变性隐窝病灶(一种结直肠癌癌前病变)的产生、鸡胚绒毛尿囊膜血管的生成及内皮细胞ECV340的增殖和迁移能力[12-13]。

本研究发现,七叶皂苷钠对人甲状腺未分化癌细胞HTh74的增殖具有抑制作用,且随着药物浓度的升高,抑制作用逐渐增强,此外,这种抑制作用还呈现明显的时间依赖性,48 h的IC50为69.4 μmol/L,72 h的IC50为32.5 μmol/L。

通过Western印迹检测七叶皂苷钠处理48 h后HTh74细胞中Akt、p-Akt以及多种cycline、CDK的表达水平,仅观察到Akt、p-Akt和CDK2的降低,而其他CDK如CDK1和CDK6以及cyclin D和cyclin E的表达水平则没有明显变化。这些结果提示七叶皂苷钠对HTh74细胞增殖的抑制作用可能是通过抑制Akt表达和活性以及下调CDK2的表达来实现的。

注:与对照组相比,aP<0.05,bP<0.01;Akt:蛋白激酶B;CDK:细胞周期蛋白依赖性激酶;Cyclin:细胞周期蛋白图3 不同浓度七叶皂苷钠处理HTh74细胞48 h后,Akt、p-Akt、CDK2、CDK1、CDK6、cyclin D以及cyclin E蛋白水平的变化

Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,作为磷脂酰肌醇3激酶下游信号通路的分子,参与细胞增殖、凋亡以及细胞周期等的调控[14]。磷脂酰肌醇3激酶/Akt信号通路的活化可以促进细胞增殖、抑制多种原因导致的细胞凋亡、促进细胞周期进展以及参与血管形成等[15]。本研究中,七叶皂苷钠作用于HTh74细胞后,Akt及p-Akt的表达水平均显著降低,提示七叶皂苷钠对HTh74细胞增殖的抑制作用可能是通过降低Akt的表达及抑制Akt的活化而实现的。

CDK也是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其催化活性通过正调节因子cyclin和负调节因子CDK抑制因子CDI的相互作用而进行调节。Cyclin与CDK的丝氨酸/苏氨酸特异的催化位点相互作用,不仅可以控制激酶的活性,还可以决定底物的特异性。早在20世纪80年代,CDK/cyclin复合物就被证实参与细胞周期调控。目前CDK家族至少有20余个成员被鉴定出来,每一种都有一个保守的催化核心区、一个cyclin结合区以及一个有活性的T环基序。与CDK家族不同,cyclin家族成员虽多,但分类标准非常单一,仅根据介导与CDK结合的周期蛋白框的不同而分类,包括cyclinA,B,C,D,E,F等,其周期蛋白框外的序列差异直接导致cyclin的调节差异及功能多样性[16]。其中cyclinE与CDK2结合形成cyclin E-CDK2复合物,后者为细胞从G1期进入S期的关键激酶复合物,其通过促进Rb的磷酸化,释放转录因子E2F,促进细胞周期G1/S期进程的顺利进行[17]。本研究发现七叶皂苷钠能够抑制甲状腺未分化癌HTh74细胞中CDK2的表达,表明至少在HTh74细胞株中,七叶皂苷钠有可能是通过降低CDK2的表达水平而将细胞阻滞在G1期,从而抑制细胞增殖的。

目前,关于七叶皂苷钠与甲状腺癌的研究尚属空白领域,本研究发现七叶皂苷钠能够抑制甲状腺未分化癌细胞HTh74的增殖,并且这种抑制作用可能是通过降低Akt、p-Akt以及CDK2的表达水平进而影响其下游通路来实现的。这些结果为将七叶皂苷钠作为治疗甲状腺未分化癌的潜在药物提供了理论支持,但在临床应用之前还需要开展更多、更深入的研究。

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InhibitoryeffectsofsodiumaescinateoncellproliferationinhumananaplasticthyroidcarcinomacellHTh74

LiXingjia,ZhengQuanxi,ChenGuofang,MaoXiaodong,LiuChao.

JiangsuProvinceHospitalonIntegrationofChineseandWesternMedicineAffiliatedtoNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,JiangsuProvincialAcademyofChineseMedicine,KeyLaboratoryofTCMSyndrome&TreatmentofYingbingofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210028,China

Correspondingauthor:LiuChao,Email:liuchao@nfmcn.com

ObjectiveTo investigate the potent inhibitory effects of sodium aescinate on human anaplastic thyroid cancer cell line HTh74 and its molecular mechanism.MethodsDifferent concentrations of sodium aescinate(0, 20, 40, 60, 80 μmol/L) were used to treat HTh74 cells for 48 h, and the morphological changes of cells were observed. After treated with different concentrations of sodium aescinate(0, 20, 40, 60, 80 μmol/L), 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)assay was used to detect the inhibitory effects of sodium aescinate on proliferation of HTh74 cells and cell proliferation rate, 50% inhibitory concentration(IC50)were calculated. After treated with different concentrations of sodium aescinate(0, 5, 10, 15, 20, 25 μmol/L), Western blotting was performed to detect the expression of protein kinase B(Akt), phosphorylated Akt (p-Akt) and cell cycle-related proteins.ResultsAfter treated with sodium aescinate, cells shrinked significantly in a dose dependent manner. MTT assay showed that sodium aescinate had obvious inhibitory effect on HTh74 cell growth in a time and dose dependent manner, when treated with 80 μmol/L sodium aescinate for 24 h, the inhibitory effects on the cell growth had statistical significance (F=111.4,P<0.01), while treated with 40 μmol/L for 48 h and 72 h, the cell growth was inhibited (F=543.6,722.1,allP<0.01), and the IC50was 69.4 μmol/L at 48 h and 32.5 μmol/L at 72 h. The expression of Akt, p-Akt and cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) significantly decreased in a dose dependent manner after treated with sodium aescinate for 48 h. Compared with untreated cells, expression of Akt and p-Akt began to decrease when treated with low concentration (5 μmol/L and 10 μmol/L) of sodium aescinate (F=613.9,P<0.05),while expression of CDK2 decreased when treated with 15 μmol/L sodium aescinate (F=208.9, 208.3, allP<0.05). But the expression of CDK1,CDK6,cyclin D and cyclin E were not different among the groups (allP>0.05).ConclusionSodium aescinate can inhibit the proliferation of HTh74 cells, and the molecular mechanisms may be mediated by regulation of Akt, p-Akt and CDK2.

Anaplastic thyroid cancer; HTh74; Sodiun aescinate; Cell cycle; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.02.010

210028 南京中医药大学附属中西医结合医院,江苏省中医药研究院,国家中医药管理局瘿病证治重点研究室

刘超,Email:liuchao@nfmcn.com

2015-07-09)

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