尿L-FABP、KIM-1、NGAL和血清cystatin C在糖尿病肾病中的变化及意义

梁雅灵 杨茂君 李衍辉 黎秋晗 黄炜 徐勇

临床研究

·论著·

尿L-FABP、KIM-1、NGAL和血清cystatin C在糖尿病肾病中的变化及意义

梁雅灵 杨茂君 李衍辉 黎秋晗 黄炜 徐勇

目的探讨尿液肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、肾损伤分子-1(KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)和血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin) C水平在糖尿病肾病患者中的改变以及临床意义。方法纳入2011年10月至2012年10月泸州医学院附属医院内分泌科确诊为2型糖尿病(T2DM)的住院患者118例，根据尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)分为正常白蛋白尿组(n=45)、微量白蛋白尿组(n=42)以及大量白蛋白尿组(n=31)。同时选择同期健康体检者41名作为正常对照组。采用ELISA法检测尿L-FABP、KIM-1和NGAL，免疫比浊法检测血清cystatin C。所有尿液检测指标经尿肌酐校正，比较各组间各标志物的变化情况及与UACR、估计的肾小球滤过率(eGFR)的相关性。结果与正常对照组相比，糖尿病各组尿L-FABP和血清cystatin C水平明显升高，(χ2=77.959，104.003，P均<0.05)；尿KIM-1水平亦明显升高(χ2=29.711，P<0.05)。微量白蛋白尿组与大量白蛋白尿组尿NGAL水平较正常对照组和正常白蛋白尿组明显升高(χ2=23.833，P<0.05)，但在正常白蛋白尿组与正常对照组间未见明显变化。尿L-FABP、KIM-1、NGAL及血清cystatin C与UACR呈正相关(r=0.719，0.427，0.327，0.726，P均<0.01)；仅L-FABP、血清cystatin C与eGFR呈负相关(r=-0.301、-0.791，P<0.01)。结论尿L-FABP、KIM-1、NGAL和血清cystatin C 在糖尿病肾病早期显著升高，其中尿L-FABP和血清cystatin C可能是反映糖尿病肾损伤较好的生物学指标。

糖尿病肾病；肝型脂肪酸结合蛋白；肾损伤分子-1；中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白；血清cystatin C

糖尿病肾病(DN)的病程呈进行性不可逆发展，严重影响患者的预后和生命，因此早期诊断和治疗至关重要。微量白蛋白尿作为早期识别DN最主要的依据之一，因其检测时出现较大的变异性以及与肾功能损害进展缺乏一致性，常出现在早期肾损伤之后[1]。因此急切需要寻找能够预测或诊断早期DN的有效生物学标志物。

尿肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、肾损伤分子-1(KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)常反映肾小管-间质损伤，是近年来诊断急性肾损伤比较新颖的生物学标志物[2-4]。另外血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)C 因与年龄、性别、肌肉量、饮食、血脂和炎性反应无关，且在小儿及中、老年中均适用，在肾小球早期损害中其敏感性高于血肌酐等其他指标，故已成为反映肾小球滤过率非常稳定的指标[5]。

目前，虽然肾损害的早期诊断标志物引起了广泛关注和研究，但是较少有研究同时关注尿L-FABP、KIM-1、 NGAL和血清cystatin C是否能成为诊断早期DN的重要标志物。故本研究以2型糖尿病患者为研究对象，检测尿L-FABP、KIM-1、NGAL及血清cystatin C水平，观察其与尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)及估计的肾小球滤过率(eGFR)的相关性，探讨其在 DN患者中的改变及临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2011年10月至2012年10月在沪州医学院附属医院内分泌科住院治疗的118例2型糖尿病患者， 均符合1999年世界卫生组织糖尿病诊断和分型标准且年龄>40岁。排除标准：(1)泌尿系统疾病，如原发性肾炎或其他继发性肾炎，泌尿系统感染，急、慢性肾功能不全等。(2)合并高血压、妊娠、恶性肿瘤、外伤、严重心功能不全、痛风、自身免疫性疾病、肝病和近期感染等。根据UACR将糖尿病患者分为3组：正常白蛋白尿组45例，男18例，女27例，平均年龄(59.0±8.4)岁，UACR <30 mg/g；微量白蛋白尿组42例，男17例，女25例，平均年龄(61.9±8.7)岁，UACR 30～300 mg/g；大量白蛋白尿组31例，男15例，女16例，平均年龄(60.1±10.0)岁，UACR>300 mg/g。另选同期健康体检者41名作为正常对照组，男10名，女31名，平均年龄(58.2±10.2)岁。本研究得到我院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料及标本收集 无菌尿管收集研究对象清洁中段尿液标本5 ml，4 000 r/min(r=13 cm)离心 5 min，存于-80℃冰箱保存待检。同时空腹抽静脉血4 ml，分离血清存于-80℃冰箱保存。避免反复冻融。并且收集受试者性别、年龄、身高、体重以及本院中心实验室所检测的肾功能、生化等资料。采用中国人改良简化MRDD方程：eGFR[ml·min-1·(1.73 m2)-1]=186×(血肌酐/88.4)-1.154×年龄-0.203×(中国×1.233)×(女性×0.742)[6]。

1.2.2 试验方法 运用ELISA试剂盒分别检测尿液中L-FABP、KIM-1、NGAL浓度，试剂盒分别购自Hycult biotech、R&D systerm、Ray Biotech公司，实验方法严格按试剂盒说明书进行操作，根据标本吸光度计算标本相应的L-FABP、KIM-1、NGAL水平。血清cystatin C浓度采用免疫比浊法进行检测。

2 结果

2.1 各组一般临床资料及生化指标比较 各组年龄、身高、体重及体重指数比较差异无统计学意义(P均>0.05)。正常白蛋白尿组、微量白蛋白尿组、大量白蛋白尿组病程、空腹血糖、餐后血糖、平均血糖、HbA1c水平均明显高于正常对照组(P均<0.05)。

随着UACR的增加，血肌酐、尿素氮水平逐渐升高并且在大量白蛋白尿组达最高(P<0.05)。糖尿病各组的血脂水平除甘油三酯外均有所变化，总胆固醇水平在大量白蛋白尿组中较正常白蛋白尿组、微量白蛋白尿组明显升高(P<0.05)；高密度脂蛋白-胆固醇和低密度脂蛋白-胆固醇水平在正常白蛋白尿组与微量白蛋白尿组中均较正常对照组降低(P<0.05)。另外，糖尿病各组中血清白蛋白随着UACR增加而降低，并且在大量白蛋白尿组达最低(P<0.05)，而糖尿病各组中的血红蛋白较正常对照组呈降低趋势，且在大量白蛋白尿组达最低(P<0.05)，见表1。

2.2 各组尿L-FABP、KIM-1、NGAL及血清cystatin C水平比较 所有尿液检测指标通过尿肌酐校正后，尿L-FABP和血清cystatin C水平在正常对照组、正常白蛋白尿组、微量白蛋白尿组和大量白蛋白尿组中呈逐渐上升趋势，并在大量白蛋白尿组中达最高，且组间比较差异具有统计学意义(P均<0.05)；尿KIM-1水平在糖尿病各组中均较正常对照组明显升高(P<0.05)；另外，尿NGAL水平在微量白蛋白尿组、大量白蛋白尿组中较正常对照组及正常白蛋白尿组明显升高(P<0.05)，但在正常白蛋白尿组中较正常对照组未见明显改变，见表2。

2.3 各检测指标与UACR及eGFR相关性分析 尿L-FABP、KIM-1、NGAL及血清cystatin C水平与UACR呈正相关，其中尿L-FABP、血清cystatin C更具有显著意义(P<0.01)[12]。仅尿L-FABP、血清cystatin C水平与eGFR呈负相关，具有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表1 4组一般临床资料及生化指标比较

注：UACR：尿微量白蛋白/肌酐比值；eGFR：估计的肾小球滤过率；与正常对照组相比，aP<0.05；与正常白蛋白尿组相比，bP<0.05；与微量白蛋白尿组相比，cP<0.05

表2 4组各检测指标水平比较

注：NGAL：中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白；KIM-1：肾损伤分子-1； L-FABP：肝型脂肪酸结合蛋白；cystatin C：半胱氨酸蛋白酶抑制物C；所有尿液检测指标均经尿肌酐校正，与正常对照组相比，aP<0.05；与正常白蛋白尿组相比，bP<0.05；与微量白蛋白尿组相比，cP<0.05

表3 各检测指标与UACR、eGFR相关性分析

注：NGAL：中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白；KIM-1：肾损伤分子-1； L-FABP：肝型脂肪酸结合蛋白；cystatin C：半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；UACR：尿微量白蛋白/肌酐比值；eGFR：估计的肾小球滤过率

3 讨论

DN早期临床症状并不典型，当出现明显而持续的蛋白尿时提示肾损害将不可逆转，最终可能发展为肾功能衰竭。因此发现新的2型糖尿病早期肾脏损伤标志物对患者作出及时诊断和干预治疗具有重要意义。

微量白蛋白尿的发生主要与肾小球早期电荷屏障受损有关，但它易受运动、月经周期、心功能不全等多种因素影响，故对预测DN进展的实用性并不理想。近期许多研究发现在部分早期DN患者中肾小管损害有时会早于肾小球，所以相对于肾小球标志物，肾小管的标志物可能更加有利于诊断早期DN[7]。

L-FABP是一种主要在肝脏中表达的游离脂肪酸携带蛋白，在近端肾小管上皮细胞内也有表达。研究显示，L-FABP不仅在慢性肾小球肾炎患者中高表达而对肾脏疾病的发生起预警作用，同时反映了肾小管间质的损伤[8]。另有研究表明在2型糖尿病患者中尿L-FABP水平显著升高，并与肌酐清除率呈负相关[9]。血清cystatin C是一类可由人体中所有有核细胞产生的蛋白，生长速度稳定，不受年龄、性别、肝病、炎性反应等多种因素影响，且肾脏是其唯一的清除途径[10]。血清cystatin C在肾小管中几乎100%被重吸收，故其可作为肾功能不全的理想内源性指标之一。本研究发现，尿L-FABP及血清cystatin C 水平在糖尿病各组中较正常对照组都显著升高；同时伴随UACR水平的升高，两者也逐渐升高，并且在大量白蛋白尿组表达最多；相关性研究显示，两者均与UACR呈正相关(r=0.719，0.726，P<0.01)，与eGFR呈负相关(r=-0.301，-0.791，P<0.01)。可见尿L-FABP及血清cystatin C水平不仅在早期DN中显著升高，而且与肾脏损伤的严重程度相一致，有助于监测DN的病情发展。

KIM-1是一种参与肾脏损伤和修复的Ⅰ型跨膜蛋白，在正常肾脏中表达甚微，当肾缺血或中毒性肾损伤时，KIM-1会在发生纤维化及炎性反应的近端小管的顶膜中高表达[11]。研究发现，在健康人群中KIM-1几乎不表达，但在1型糖尿病患者尿白蛋白正常组及微量白蛋白尿组中均显著增加[12]。本研究结果发现，尿KIM-1水平在糖尿病各组中较正常对照组显著升高，并且与UACR呈正相关(r=0.427，P<0.01)，提示在尿白蛋白尚属正常范围的情况下，尿KIM-1表达已有明显升高，因此可认为在早期DN中，尿KIM-1的出现比白蛋白尿要早。

NGAL是由一条小型而较隐秘的多肽链组成，其主要表达于近端小管，但也存在于远侧肾单位[13]。正常生理情况下表达甚微，可以保障肾脏发育,当发生急性肾损伤时NGAL表达急剧升高，可以增强肾组织内抗炎反应起到保护肾脏的作用。近来研究发现，在链脲佐菌素诱导的DN小鼠模型中，尽管肾脏NGAL基因和蛋白均有所上调，但是因为肾脏重吸收严重受损，NGAL被大量排泄于尿液中，因此尿NGAL显著升高[14]。本实验发现在微量白蛋白尿组及大量白蛋白尿组中，NGAL水平显著高于正常对照组及正常白蛋白尿组，但后两者相比无明显差异；相关性研究中，尿NGAL与UACR呈正相关(r=0.327，P<0.01)，表明虽然尿白蛋白在正常范围时NGAL表达的改变无明显意义，但在糖尿病早期仍呈显著升高趋势。

综上所述，尿L-FABP、KIM-1、NGAL及血清cystatin C具有较好的实用性，在早期DN中的表达显著升高；尿L-FABP、KIM及血清cystatin C在尿白蛋白尚属正常范围内表达便显著上调，提示三者的出现比白蛋白尿要早；另外，尿L-FABP及血清cystatin C 表达水平与肾脏损伤的严重程度相一致，有利于评估DN患者的病情发展。

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ChangesofurinaryL-FABP,KIM-1,NGALandserumcystatinCindiabeticnephropathyanditsclinicalvalue

LiangYaling,YangMaojun,LiYanhui,LiQiuhan,HuangWei，XuYong.

DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofSichuanMedicalUniversity,Luzhou646000,China

Correspondingauthor：XuYong,Email:xywyll@aliyun.com

ObjectiveTo investigate the changes of urinary liver-type fatty acid binding protein(L-FABP), kidney injury molecule-1(KIM-1), neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)and serum cystatin C in diabetic nephropathy and its clinical value.MethodsA total of 118 patients diagnosed with type 2 diabetes in the Department of Endocrinology of Affiliated Hospital of Sichuan Medical University from October 2011 to October 2012 were recruited in this study. According to their urinary albumin-to-creatinine ratio(UACR), patients were divided into normal albuminuria group(n=45), microalbuminuria group(n=42), and macroalbuminuria group(n=43). A total of 41 healthy subjects were enrolled as normal control group(n=41). Enzyme-linked immunosorbent assays were used to measure the levels of urinary L-FABP, KIM-1 and NGAL.Turbidimetric inhibition immuno-assay was used to measure the expression of serum cystatin C. All the urinary indicators were adjusted by the level of urine creatinine. Changes of biomarkers in each group and their crrelations between UACR, eGFR were also compared.ResultsCompared with normal control group, urinary L-FABP and serum cystatin C were significantly increased in diabetic groups (χ2=77.959，104.003，allP<0.05); urinary KIM-1 was also significantly increased (χ2=29.711，P<0.05). Urinary NGAL was increased in microalbuminuria group and macroalbuminuria group compared with normal control group and normal albuminuria group(χ2=23.833,P<0.05), but there were no significant difference between normal albuminuria group and normal control group. Urinary L-FABP, KIM-1, NGAL and serum cystatin C were positively correlated with UACR(r=0.719, 0.427, 0.327, 0.726, allP<0.01); while L-FABP and serum cystatin C were negatively correlated with eGFR(r=-0.301，-0.791, allP<0.01).ConclusionUrinary L-FABP, KIM-1, NGAL and serum cystatin C are increased in early diabetic nephropathy, while urinary L-FABP and serum cystatin C may be the better biomarkers to predict diabetic renal injury.

Diabetic nephropathy;Liver-type fatty acid binding protein; Kidney injury molecule-1; Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; Serum cystatin C

四川省教育厅重点项目(10ZA036)；四川省国际合作项目(14GH0003)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.02.005

646000 泸州，四川医科大学附属医院内分泌科

徐勇，Email：xywyll@aliyun.com

FundprogramEducational Commission of Sichuan Province of China(10ZA036); Project of Sichuan International Cooperation(14GH0003)

2016-07-12)