盐胁迫下耐盐苜蓿突变体的红外光谱分析

2016-11-24杨静慧秦艳筠张伟玉杨仁杰

天津农林科技 2016年5期

关键词：酸类波数耐盐

杨静慧，王　敏，李雕，秦艳筠，张伟玉，杨仁杰

（1.天津农学院园艺园林学院，天津 300384；2.天津农学院工程技术学院，天津 300384）

盐胁迫下耐盐苜蓿突变体的红外光谱分析

杨静慧1，王敏1，李雕2，秦艳筠1，张伟玉2，杨仁杰2

（1.天津农学院园艺园林学院，天津 300384；2.天津农学院工程技术学院，天津 300384）

为了研究青睐耐盐突变体的耐盐生理机制，以青睐和青睐耐盐突变体为试验材料，采用中红外光谱技术，结合二阶导数图，对其盐胁迫条件下官能团的变化进行了比较。结果表明：在盐胁迫条件下，苜蓿比对照增加了1个吸收峰（1 862 cm-1波数），为酸酐类C=O官能团；耐盐苜蓿突变体比对照增加了1个吸收峰（1 440 cm-1波数），对应的官能团为C-H，为饱和烃类，包括烷烃、环烷烃、芳香烃类等，减少了1个吸收峰（1 640 cm-1波数），即萘环C=C官能团。在正常生长条件下，耐盐突变体比普通苜蓿多了2个吸收峰（1 589 cm-1和1 640 cm-1），对应的官能团是胺类、酰胺类N-H和脂肪酸类C=O；少了1个吸收峰（1 608 cm-1），对应的官能团是芳烃类C=C。总之，分析显示盐胁迫变化的敏感特征峰普通苜蓿为1 862 cm-1，耐盐苜蓿突变体为1 440 cm-1，耐盐突变体的红外光谱检测发现了3个大的差异峰。所以，红外光谱分析技术可以用于突变体鉴定。

苜蓿；突变体；盐胁迫；红外光谱

苜蓿被誉为“牧草之王”，也是世界公认的健康食品和中草药[1]。苜蓿是绿肥,是豆科植物，具有固氮作用，在抗旱、抗风沙、防止水土流失、改良土壤、保护生态环境等方面也起到积极的作用[2]。但是，苜蓿的耐盐性还有待提高，以用于盐碱地的改良[3]。近年来，苜蓿的耐盐育种研究逐渐增加，获得了大量的突变体[4-5]。如何进行突变体的快速鉴定是育种研究者急于解决的问题。是否能将分析速度快、样品无损耗、成本低和无污染[6-7]的红外光谱技术用于苜蓿突变体的筛选和分析突变体变异的主要官能团和成分是本研究的主要目的。

1　材料和方法

1.1材料

苜蓿品种为青睐，青睐植株（CK）和青睐突变体的普通愈伤组织和松散型胚性愈伤组织由天津农学院园林植物实验室提供。其中青睐突变体是在0.3%EMS（诱变剂）和0.6%NaCl浓度的培养基上通过耐盐筛选得到耐盐突变愈伤组织，再经过细胞再生获得的突变体。普通愈伤组织和松散型胚型愈伤组织的诱导按照刘艳军[8]和秦艳筠[9]的方法获得。

1.2方法

1.2.1样品耐盐处理和采集

将不同处理的愈伤组织分别称取0.5 g，放进纱布中，浸入2%盐水中1 h。对照为清水浸泡。每处理3次重复。再将其放进烘干箱，先在105 ℃条件下烘干30 min，然后于55 ℃下持续烘干900 min，至完全干燥。粉碎，过0.15 mm准筛。各取1.5 mg，KBr 红外光谱仪—KBr压片法制样，测定。每处理设4次重复。

1.2.2样品测定和数据分析

采用PerkinElmer公司FT-IR Spectrometer Froniter红外光谱仪对上述样品压片通过透射方式进行红外采集，DTGS检测器。光谱分辨率4 cm－1，测量范围4 000～400 cm-1，OPD速度0.2 cm·s-1,增益为1,每个样品累计扫描16次。扫描时扣除H2O和 CO2的干扰。光谱采集和一维、二维谱分析均采用Pekin Elmer公司的Spectrum v 5.0.1软件处理获得;2维平滑点数为11。运用origin7.5软件进行红外光谱与二阶导数红外光谱分析。

2　结果与分析

2.1盐胁迫下普通苜蓿的红外光谱分析

从图1中可以看出，对照CK与盐胁迫处理后的苜蓿愈伤组织（苜蓿盐胁迫）的红外光谱图无明显差异，有5个波峰，分别是 1 052 cm-1、1 401～1 404 cm-1、1 599～1 608 cm-1、2 933 cm-1、3 348 cm-1，其中在1 052 cm-1波数上的吸收峰是醇类C-O、醚类 C-O-C (脂肪烃)、胺类C-N（烷基碳）伸缩振动吸收。在1 401～1 404 cm-1波数上吸收峰是酸类O-H面内变形振动吸收。在1 599～1 608 cm-1波数上吸收峰是芳烃类C=C苯环骨架振动吸收、胺类N-H变形振动吸收、酰胺类N-H（伯酰胺）变形振动吸收。在2 933 cm-1波数上的吸收峰是酸类O-H（二聚体）伸缩振动吸收。在3 348 cm-1波数上的吸收峰是醇类O-H、胺类N-H、酰胺类N-H伸缩振动吸收。

图1　苜蓿与盐胁迫下苜蓿的红外光谱图

2.2盐胁迫下普通苜蓿的二阶导数分析

从二阶导数图中可以看出，苜蓿愈伤组织盐胁迫处理后比对照增加了1个特征峰，波数是1 862 cm-1，对应的官能团为酸酐类C=O，该类物质为酸类，包括无机酸和有机酸。苜蓿突变体盐胁迫后酸类物质有所增加，这与孙伟泽在NaCl 胁迫对紫花苜蓿七种生理生化指标影响研究一文中提到的植物在盐胁迫下通过分泌有机酸，阻止盐分进入体内的内容相符合。进一步推测这种酸类物质可能是茉莉酸类物质（JAS）。

JAS被公认为一类新型植物内源生长物质,这类化合物具有生长物质活性。植物在机械伤害、病虫害、干旱、盐胁迫等条件下的抗逆反应都与茉莉酸类物质的作用密切相关。在环境胁迫条件下JAS是驱动植物防御基因表达过程中信号传递的必要组成部分。在创伤、水分亏缺和渗透胁迫时，燕麦、大豆、烟草、拟南芥、大麦和玉米等植物中内源 JAS 含量急剧上升[10]。所以，1 862 cm-1吸收峰是苜蓿盐胁迫反应的特征峰。

2.3盐胁迫处理下的耐盐苜蓿突变体的红外光谱分析

从图2中可以看出，对照CK的二阶导数图有16个吸收峰，盐胁迫处理的有17个吸收峰。其中共同峰是在波数696～1 812 cm-1范围内，696 cm-1波数对应的是酰卤类C=Cl伸缩振动、芳烃类C-H（单取代）、C-H（间位双取代）面外变形振动，在767 cm-1波数对应的是芳烃类C-H（间位双取代）面外变形振动，832～834 cm-1波数对应的是芳烃类C-H（对位双取代）的面外变形振动吸收，920～922 cm-1波数对应的是酸类O-H的面内变形振动吸收和酸酐类的C-O伸缩振动吸收，996～998 cm-1波数对应的是酸酐类C-O的伸缩振动吸收，1 050 cm-1波数对应的分别是醇类的C-O、醚类的C-O-C（脂肪烃）、酸酐类C-O、胺类的C-N（烷基碳）的伸缩振动吸收，1 150 cm-1波数上对应的分别是醇类的C-O、醚类的C-O-C（脂肪烃）、胺类的C-N（烷基碳）、酮类的C-C的伸缩振动吸收，1 240 cm-1波数对应的分别是醇类C-O、醚类C-O-C（脂肪烃）、酸类C-O-C、酯类C-O-C（乙酸酯）、酮类C-C的伸缩振动吸收，1 329 cm-1波数对应的是胺类C-N(芳基碳)的伸缩振动吸收，波数1 438～1 440 cm-1对应的是酸类O-H面内变形振动吸收，1 500 cm-1波数对应的是胺类N-H变形振动吸收，1 528～1 529 cm-1波数对应的是胺类N-H、酰胺类N-H(仲酰胺)变形振动吸收，1 600 cm-1波数对应的是胺类N-H、酰胺类N-H（伯酰胺）变形振动吸收，酰胺类C=O伸缩振动吸收，1 740 cm-1波数对应的是酸类C=O、酯类C=O、酸酐类C=O伸缩振动吸收，1 812 cm-1波数对应的是酸酐类C=O伸缩振动吸收。

图2　苜蓿与盐胁迫下苜蓿的二阶导数红外光谱图

从图3中可以看出，盐胁迫下苜蓿突变体与对照CK的红外光谱图大体相似，有6个波峰。分别在1 049～1 052 cm-1、1 403～1 404 cm-1、1 589～1 596 cm-1、1 640～1 665 cm-1、2 926 cm-1、3 348 cm-1。各吸收峰对应的官能团同前2.1。

图3　盐胁迫下苜蓿突变体的红外光谱图

2.4盐胁迫下苜蓿突变体的的二阶导数分析

从图4可以看出，盐胁迫下的苜蓿突变体与对照CK的二阶导数图分别有18、17个吸收峰。各吸收峰对应的官能团同前2.2。在1 401～1 500 cm-1波数区间，盐胁迫使苜蓿突变体比对照CK增加了1个特征峰，波数是1 440 cm-1，对应的官能团为C-H，为饱和烃类，对应的物质为烷烃、环烷烃、芳香烃类等。但是，在1 500~1 680 cm-1波数范围内，盐胁迫使苜蓿突变体比对照CK减少了1个特征峰，该峰的波数是1 640 cm-1, 对应的官能团为芳烃类C=C。

图4　盐胁迫下苜蓿突变体的的二阶导数红外光谱图

2.5普通苜蓿与苜蓿突变体的红外光谱分析

从图5中可以看出，普通苜蓿CK与苜蓿突变体在正常生长条件下的红外光谱图有明显差异，普通苜蓿有5个波峰，苜蓿耐盐突变体有6个波峰。其中二者共同的吸收峰的波数分别是1 052 cm-1、1 404 cm-1、3 348 cm-1。

在1 404~2 933 cm-1波数范围内，苜蓿耐盐突变体增加了2个特征峰，波数分别是1 589 cm-1和1 640 cm-1，减少了1个特征峰，波数是1 608 cm-1，三处波峰对应的官能团相同，但可以从出现特征峰的位置进行区分。

图5　普通苜蓿与苜蓿耐盐突变体的红外光谱图

2.6普通苜蓿与苜蓿突变体的二阶导数分析

从图6可以看出，普通苜蓿与苜蓿突变体的二阶导数图分别有16和17个吸收峰。在波数696～1 330 cm-1范围内，共有的峰是696 cm-1、767～768 cm-1、832～836 cm-1、922～924 cm-1、996～998 cm-1、1 050 cm-1、1 150 cm-1、1 240 cm-1、1 329～1 330cm-1波数。

图6　普通苜蓿、苜蓿耐盐突变体的二阶导数红外光谱图

3　结　论

与普通苜蓿相比，耐盐突变体在1 329～1 500 cm-1范围内增加的特征峰的波数是1 410 cm-1，减少的特征峰的波数是1 440 cm-1，它们对应的官能团是酸类O-H。在1 500～1 840 cm-1范围内，耐盐突变体比普通苜蓿增加1 640 cm-1、1 790 cm-1、1 840 cm-1处的吸收峰，其中1 640 cm-1处对应的官能团是芳酮C=O。在1 790 cm-1和1 840 cm-1处对应的官能团是环酸酐C=O。耐盐突变体比普通苜蓿减少的特征峰的波数是1 812 cm-1，对应的官能团是酰卤类C=O。

总之，在盐胁迫条件下，盐使苜蓿增加了1个吸收峰1 862 cm-1，为酸酐类C=O；盐使耐盐苜蓿突变体增加了1个1 440 cm-1吸收峰，对应的为饱和烃类C-H，减少了1 640 cm-1吸收峰，即芳烃类萘环C=C。

在正常生长条件下，耐盐突变体与普通苜蓿的差异是，耐盐突变体增加了2个特征峰（ 1 589 cm-1和1 640 cm-1），减少了1个特征峰，波数是1 608 cm-1，3处波峰对应的官能团一样，但可以从出现特征峰的位置进行区分。

[1]高宇，石杰，王云云，等.苜蓿的药用功效和开发利用[J].畜牧与饲料科学，2011，32（12）：25-26.

[2]严衍禄，赵龙莲，韩东海，等.近红外光谱分析基础与应用[M].北京:中国轻工业出版社，2005.

[3]胡明贵，张德魁.盐渍地人工苜蓿草地生产力与土壤改良研究[J].安徽农业科学，2008，36（17）：7421-7422， 7463.

[4]米伟，杨静慧.盐胁迫下转过表达HS转录因子苜蓿突变体的生理生化变化[J].分子植物育种，2015，13（3）：658-662.

[5]杜长城，杨静慧，任慧朝，等.不同品种紫花苜蓿的耐盐性筛选试验[J].天津农业科学，2008，14（5）：14-16. [6]武春霞，杨跃，杨静慧，等.盐胁迫下3种耐盐植物的种子萌发和生长及其耐盐性研究[J].安徽农业科学，2008，36（10）：3968-3969， 3979.

[7]胡妍妍，王颖，杨静慧，等.不同类型苜蓿愈伤组织细胞形态结构比较[J].华北农学报，2014，29（5）：130-133.

[8]田瑞娟，杨静慧，梁国鲁.不同品种紫花苜蓿耐盐性研究[J].西南农业大学学报（自然科学版），2006，28（6）：93-97.

[9]杨静慧，秦艳筠，刘婷，等.两种愈伤组织生理生化特性和形态结构比较[J].天津农业科学，2014，20（8）：22-24.

[10]李红利，孙振元，赵梁军，等.茉莉酸类物质对植物生长发育及抗性的影响[J].中国农学通报，2009，25（16）：167-172.

试验研究