安脑片对血管性痴呆模型大鼠的保护作用及机制

徐敬轩 栾新平

(新疆医科大学第二附属医院神经外科，新疆 乌鲁木齐 830028)



安脑片对血管性痴呆模型大鼠的保护作用及机制

徐敬轩 栾新平

(新疆医科大学第二附属医院神经外科，新疆 乌鲁木齐 830028)

目的 探讨安脑片对血管性痴呆(VD)大鼠空间学习记忆障碍的保护作用及机制。方法 健康雄性SD大鼠72只，随机分为假手术组、模型组、安脑片低、中、高剂量组(50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg)及盐酸多奈哌齐组(0.5 mg/kg)，每组12只。VD大鼠模型采用双侧颈总动脉结扎法制备，术后给药30 d。采用Morris水迷宫试验评价大鼠的空间学习记忆能力，比色法检测大鼠海马乙酰胆碱酯酶(AChE)和乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性，Western印迹测定大鼠海马组织中Bcl-2、Bax及Caspase-3的表达。结果 与假手术组比较，模型组大鼠学习记忆能力显著降低，大鼠逃避潜伏期及游泳距离明显延长，穿越平台区次数及平台象限游泳距离百分比显著降低；ChAT活性明显降低，AChE活性显著增强；海马组织中Bcl-2/Bax比值降低，活性Caspase-3表达增加。安脑片中、高剂量均能改善VD大鼠学习记忆能力，缩短大鼠逃避潜伏期及游泳距离，增加大鼠穿越平台次数及平台象限游泳距离百分比，增强ChAT活性，降低AChE活性，使海马组织中Bcl-2/Bax比值增高，活性Caspase-3表达降低。结论 安脑片明显改善VD大鼠的学习记忆能力，其保护作用可能与其提高大鼠海马乙酰胆碱水平，减少神经细胞凋亡等有关。

安脑片；血管性痴呆；学习记忆；神经递质；凋亡

血管性痴呆(VD)是由各种脑血管疾病引起的一种慢性、进行性的获得性智能损害综合征〔1〕。近年来中药在VD的防治上取得了良好的进展〔2～4〕。安脑片由人工牛黄、猪胆汁粉、朱砂、冰片、水牛角浓缩粉等15味药组成，功能主治为清热解毒，醒脑安神，豁痰开窍，镇惊熄风。临床应用非常广泛，但主要是以脑系统病变为主的病症，如中风窍闭证、阿尔茨海默病〔5〕、癫痫、中老年血管性偏头痛等，但安脑片对VD的药理作用尚未见报道。本实验观察安脑片对VD模型大鼠学习记忆能力、海马组织中胆碱能神经递质水平、海马组织凋亡因子Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 仪器、药品及试剂 ZS001型Morris 水迷宫试验系统(北京众实迪创科技发展有限责任公司)，Multiskan MK3型酶联仪(芬兰Thermo公司)，Motic Med 6.0 数码医学图像分析系统( 北京航空航天大学)。安脑片(批号150401，哈尔滨蒲公英药业有限公司，规格：0.5g/片)；盐酸多奈哌齐片〔批号150106，卫材(中国)药业有限公司，规格：5 mg/片〕；乙酰胆碱酯酶(AChE)、乙酰胆碱转移酶(ChAT)检测试剂盒(批号2015039，南京建成生物技术有限公司)；鼠抗β-actin一抗(美国Santa Cruz公司)；兔抗Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗(美国Cell Signaling Technology公司)；抗兔荧光二抗(Rockland公司)；其他试剂均为分析纯。

1.2 动物 清洁级雄性SD大鼠，体重250～350 g，由哈尔滨蒲公英药业有限公司动物实验中心提供〔动物使用许可证号：SXCK2007-001〕，于哈尔滨蒲公英药业有限公司实验室饲养。

1.3 模型的复制 大鼠VD模型采用永久性双侧颈总动脉结扎法制备〔6〕。大鼠术前12 h禁食，自由饮水。术前腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)进行麻醉。麻醉后大鼠仰卧固定于手术台上，颈前区备皮，碘伏消毒，行颈正中切口长约1.5 cm，钝性分离皮下组织及肌肉见颈总动脉鞘，小心游离迷走神经，分离出颈总动脉后，近心端及远心端“4”号线双重结扎，并中间离断，确保阻断动脉血流。术中动作轻柔，避免钳夹和过分牵拉迷走神经。逐层缝合肌肉及皮肤，切口局部碘伏消毒。术中以红外线恒温灯维持大鼠体温在(37±0.5)℃，并保证大鼠自主呼吸，术后放回笼中常规饲养。假手术组只做切开、缝合等处理，不结扎颈总动脉。

1.4 分组与给药 72只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、安脑片低、中、高剂量组(分别按50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg给药)〔7〕、盐酸多奈哌齐片组(0.5 mg/kg)〔8〕，每组10只。术后灌胃给药，每天2次，连续给药30 d。安脑片临用前用蒸馏水配制成50 mg/ml的混悬液，盐酸多奈哌齐片用蒸馏水配制成0.5 mg/ml的混悬液，按大鼠体重计算给药量稀释为1 ml混悬液给予灌胃。假手术组及模型组每天给予等体积蒸馏水灌胃。

1.5 大鼠学习记忆能力的观察 采用Morris水迷宫法对大鼠学习和记忆功能进行评估〔9〕。Morris水迷宫准备：实验室采用灯光照明，迷宫外参照物保持固定，水迷宫内加入溶解黑色食用色素的生活饮用水。将水池等分为四个象限，进行试验时水温控制在25℃±2℃。(1)定向航行实验：选取第一象限正中位置放置一直径为8 cm的平台，没入水下2 cm，将大鼠从第三象限面朝向池壁轻轻放入水中，记录60 s内找到并爬上平台所用的时间和路程，若大鼠60 s内尚未找到平台，则将其引导至平台停留15 s，逃避潜伏期记录为60 s。取6 d的平均成绩作为测试的成绩。(2)空间探索实验：定向航行实验结束后撤除平台，让大鼠在水池中游60 s来寻找平台，记录大鼠60 s内跨越平台所在象限次数、在平台所在内象限游动的距离与游泳总距离的比值，取6 d的平均成绩作为测试的成绩。

1.6 大鼠海马组织中ChAT、AChE活性测定〔10〕Morris水迷宫实验结束后，大鼠断头取脑，分离海马组织，放入4℃生理盐水冲洗残留血液，称重。从各组12只海马组织中随机选取8只海马组织加入预冷生理盐水，超声波匀浆，制备10%的组织匀浆液，4 000 r/min离心10 min，取上清液备用。按试剂盒说明书中所述ELISIA法测定ChAT、AChE活性。

1.7 Western印迹测定大鼠脑海马组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达 用细胞裂解液抽提海马组织总蛋白进行10%SDS-PAGE蛋白电泳，4℃环境中100 V恒压转膜1.5 h，5%脱脂奶粉室温封闭PVDF膜0.5 h；0.01 mol/L PBS稀释一抗(1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜。荧光二抗(1∶5 000稀释)反应1 h，Motic Med 6.0 数码医学图像分析系统进行图像分析。以β-actin作为内参。

1.8 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 安脑片对各组大鼠学习记忆的影响 与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期及寻找平台游泳路程明显延长，撤除平台后，在60 s内穿越平台次数及平台象限游泳路程百分比明显降低(P<0.05)，说明模型复制成功；与模型组比较，安脑片给药干预后，安脑片中、高剂量组大鼠的逃避潜伏期及寻找平台游泳路程均明显缩短，撤除平台后，在60 s内穿越平台次数增多，平台象限游泳路程百分比明显升高(均P<0.05)，其效果与盐酸多奈哌齐组相当，说明安脑片中高剂量对VD模型大鼠的记忆及学习能力具有改善作用。见表1。

表1 安脑片对VD大鼠学习、记忆能力、海马ChAT、AChE活性的影响

1)与假手术组比较；2)与模型组比较；下表同

2.2 安脑片对各组大鼠海马组织AChE、ChAT活性的影响 模型组大鼠海马组织AChE活性对比假手术组明显升高、而ChAT活性明显降低(P<0.05)，说明模型组大鼠海马组织中乙酰胆碱含量减少；与模型组比较，安脑片50 mg/kg药物干预后AChE活性未见显著性改变，ChAT明显降低(P<0.05)。安脑片100 mg/kg、150 mg/kg及盐酸多奈哌齐组药物干预后，AChE活性降低，ChAT活性升高(P<0.05)，说明安脑片中、高剂量对VD大鼠海马组织内乙酰胆碱能神经递质具有很好的改善作用。见表1。

A.假手术组；B.模型组；C.安脑片中剂量组(100 mg/kg)；D.盐酸多奈哌齐组；下图同图1 大鼠海马组织中Bcl-2及Bax的表达

2.3 安脑片对各组大鼠海马组织Bcl-2、Bax及Caspase-3表达的影响 见图1，图2，表2。与假手术组比较，模型组大鼠海马组织Bcl-2/Bax比值明显降低、活性Caspase-3表达明显升高(P<0.05)；安脑片100 mg/kg及盐酸多奈哌齐组药物干预后，大鼠海马组织Bcl-2/Bax比值明显升高、活性Caspase-3表达明显降低，与模型组比较具有显著差异(P<0.05)，说明安脑片可有效降低VD大鼠海马组织神经细胞的凋亡。

图2 大鼠海马组织中Caspase-3的表达

表2 安脑片对VD大鼠海马组织Bcl-2/Bax及Caspase-3的影响

3 讨 论

近年来，VD的发病率随着人口老龄化、脑血管病等老年性疾病的发病率升高而逐年增高〔11～13〕。VD认知功能受损的形态学基础是中枢胆碱能神经元的损伤，而胆碱能系统与记忆的形成和贮存密切相关。ChAT与AChE作为乙酰胆碱的合成关键酶与分解酶，二者共同调节乙酰胆碱的动态平衡，故可作为估算乙酰胆碱含量的间接标准。有研究证实，VD患者脑组织乙酰胆碱含量减少〔14〕，给予VD大鼠拟胆碱能药物，可明显改善VD大鼠的学习记忆功能〔15〕。本研究发现，安脑片药物干预后，VD大鼠海马组织内ChAT活性增强，AChE活性明显降低，可对抗缺血损伤造成的胆碱能神经系统的功能紊乱。

大鼠海马是与学习记忆关系最为密切的功能区，具有对缺血缺氧很敏感的特点。研究发现VD大鼠海马CA1区神经元凋亡，说明海马去大量神经元丢失，是VD发生的可能病理基础〔16〕。Caspase-3作为细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，在细胞凋亡中起着不可替代的作用，同时，在凋亡基因调控中，Bcl-2及Bax家族起着重要调节作用，Bcl-2 /Bax比值降低则促进凋亡的发生〔17〕。本研究发现，安脑片能降低VD大鼠海马组织中活性Caspase-3的表达，增加Bcl-2/Bax表达比值，说明安脑片可减少脑缺血引起的神经细胞凋亡，减少神经元的不可逆的缺失，其具体机制可能与其对抗脑缺血时可产生大量自由基，导致脂质过氧化损伤有关。

本研究发现，VD模型大鼠的学习记忆功能下降，安脑片中高剂量组可明显改善其学习记忆功能，其可能的机制为：①提高海马组织中神经递质乙酰胆碱含量，使海马胆碱能神经系统功能得以恢复；②可能通过调节凋亡相关基因及蛋白的表达，降低海马组织神经元的凋亡，从而抑制海马组织神经细胞脱失，改善VD大鼠的认知功能。

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〔2015-12-03修回〕

(编辑 曹梦园)

徐敬轩(1980-)，男，硕士，副主任医师，主要从事脑血管疾病、颅底肿瘤研究。

R285；R332

A

1005-9202(2016)19-4693-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.009