扣囊复膜酵母与酿酒酵母混合液态发酵改善糯米酒风味的研究

杨子琳，伍时华，黄翠姬，易弋

（广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006）

扣囊复膜酵母与酿酒酵母混合液态发酵改善糯米酒风味的研究

杨子琳，伍时华*，黄翠姬，易弋

（广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006）

为了改善酿酒酵母单菌种液态发酵糯米酒的风味，将扣囊复膜酵母3-1Y与酿酒酵母SJ4进行混合发酵，比较混合发酵与酿酒酵母单菌种发酵糯米酒的差异性，并用PCA（主成分分析法）分析混合发酵糯米酒中风味物质含量.结果表明：混合发酵与SJ4单菌种发酵相比，糯米酒中总酸和氨基酸态氮含量分别提高了17.3％，19.8％；甲醇、异丁醇、异戊醇的含量分别由417.4mg／L，321.3mg／L，4.4mg／L降至23.6mg／L，1.3mg／L，0.047mg／L；低级酯达到733mg／L，是SJ4单菌种发酵的3.47倍.总酸、氨基酸态氮、低级酯的升高及有害醇的降低均有效改善了糯米酒的风味和口感；主成分分析混合发酵过程中风味物质含量，得出风味物质的合成活性在发酵54 h期间达到最大值，为进一步改善液态发酵糯米酒风味提供理论基础.

糯米酒；混合发酵；风味物质；主成分分析

风味物质是衡量糯米酒质量的一项重要指标，糯米酒中的风味物质主要和原料、酵母和陈酿有关.在发酵过程中酵母对风味物质的形成有很重要的作用，大部分风味物质是酵母发酵时产生的副产物［1］.早期研究认为非酿酒酵母耐酒精能力差，在酒精发酵过程中的早衰现象会对酒的风味和口感产生不利影响［2-3］.但随着研究的深入，发现非酿酒酵母合成风味物质的总含量往往是酿酒酵母的数倍甚至数十倍［4-5］，近几年研究的重点逐渐转移到酿酒酵母与非酿酒酵母的混合发酵上［6］.同一酵母属下各种酵母发酵特性不同，产生的代谢物也不相同，故发酵酒的风味也就不同，不同属之间的酵母所产生香气物质的差异更大，酒中风味物质的种类、含量与酵母菌种具有很高的相关性［7］.

以往的研究多注重工艺对其发酵结果的影响或片面追求产酒精度高的酵母菌［8］.本研究在以往研究的基础上，将扣囊复膜酵母和酿酒酵母进行混合发酵，比较混合发酵与酿酒酵母单菌种发酵的差异性，探究混合发酵的特点，为提高液态发酵糯米酒的质量和风味提供理论研究基础.

1　材料与方法

1.1原料柳州市某超市所售糯米.

1.2发酵菌株

表1　试验所用菌株Tab.1 Strains used in the experiment

1.3发酵菌悬液的制备

1.3.1霉菌孢子悬浮液的制备

霉菌孢子悬浮液制备方法按照应玲云文献［9］中所述方法.

1.3.2酵母菌悬液的制备

酵母菌悬浮液制备方法按照应玲云文献［9］中所述方法.

1.4培养基

1.4.1霉菌种子培养基［10］

200 g糯米加水浸泡4 h，将浸泡好的糯米沥干后置于水浴锅中，加水至刚刚浸没糯米，待温度上升至60℃时以10 U／g的接入量加入耐高温ɑ－淀粉酶，90℃水浴保温2 h，冷却后过滤，加水定容至1 L，分装成50mL／瓶，115℃下高压蒸汽灭菌30min.

1.4.2酵母菌种子培养基［11］（g／L）

酵母浸膏10，葡萄糖20，蛋白胨20，自然pH，在115℃温度下高压蒸汽灭菌30min.

1.4.3糯米液态发酵培养基

按照50 g／瓶的量，称取糯米加水浸泡4 h后沥干，加水至刚刚浸没糯米置于水浴锅中，待温度上升至60℃时以10U／g的接入量加入耐高温ɑ－淀粉酶，90℃保温2 h，冷却后加水定量至200 g／瓶，打浆，115℃温度下高压蒸汽灭菌30min.

1.5分析方法

1.5.1理化成分分析方法

酒精度、总糖、总酸、氨基酸态氮的测定参照《GBT 13662－2008黄酒》［12］的方法进行.

1.5.2风味物质分析方法

TM－930白酒专用毛细管柱（25m×0.53mm×0.1μm）；载气为N2；采用程序升温：起始温度45℃，恒温3min，以3.5℃／min上升至62℃，以1℃／min上升至67℃，再以25℃／min上升至200℃，保持6min；进样口、检测器温度220℃；采样结束时间30min.内标为乙酸丁酯，体积质量为34.17mg／100mL.

1.5.3数据分析用Microsoft Excel，Origin和PCA对实验数据进行统计分析.

1.6混合发酵接种方式

扣囊复膜酵母3－1Y与酿酒酵母SJ4混合发酵采用顺序接种方式：先将3－1Y以5×105个／mL的接种量接入灭菌后的液态糯米发酵培养基中，摇床120 r／min，28℃条件下培养24 h，再以5×105个／mL的接种量接入酿酒酵母SJ4，继续在摇床120 r／min，28℃的培养条件发酵66h，至培养基还原糖含量不再变化，结束发酵.

1.7液态酿造糯米酒的工艺流程图

图1　液态酿造糯米酒的工艺流程图Fig.1 Flow diagram for glutinous rice wine brewing

2　结果与分析

2.1混合菌种发酵对糯米酒理化性质的改善作用

混合菌种发酵和SJ4单菌种发酵糯米酒的理化指标如表2所示.比较混合发酵与SJ4单菌种发酵糯米酒的理化指标：混合发酵糯米酒中总糖为6.53 g／L，酒精度为9.7％，与SJ4单菌种发酵糯米酒中总糖7.6 g／L，酒精度10.4％差异不显著（P＞0.05）；糯米酒中适量的酸能起到调味解暴作用，是重要的调味物质［13］，而酒中的氨基酸态反映酒中氨基酸的总量，是糯米酒主要的营养成分，直接体现糯米酒的质量水平［14］.分析总酸和氨基酸态氮含量可知，混合发酵的糯米酒中总酸和氨基酸态氮比SJ4单菌种发酵分别高出17.3％，19.8％.总酸和氨基酸态氮含量的提高，丰富了酒体香味，明显改善了糯米酒的品质.

表2　单一和混合菌种发酵糯米酒的发酵参数Tab.2 Fermentation parameters of single and mixed fermented glutinous rice wine

2.2混合菌种发酵对糯米酒风味的改善作用

含量过高的异丁醇和异戊醇能够引起饮用者头痛，即所谓的“上头”［15］.由表3可知，SJ4单菌种发酵时异丁醇含量达321.3mg／L，严重影响了酒的品质.比较混合发酵与SJ4单菌种发酵，糯米酒中异丁醇、异戊醇的含量分别由SJ4单菌种发酵时的321.3mg／L，4.4mg／L降至1.3mg／L，0.047mg／L，这对糯米酒品质的改善有重要作用.酒中的甲醇对血管有麻痹及导致神经变性作用，尤其损害视神经，过多摄入严重时可导致失明，黄酒中不应含有甲醇［16］.混合发酵结束，糯米酒中的甲醇含量由SJ4单菌种发酵时的417.4mg／L降至23.6mg／L.3－1Y与SJ4混合发酵显著降低了糯米酒中有害醇的含量，混合发酵结束糯米酒中总高级醇含量仅有24.8mg／L.混合发酵的糯米酒中高级醇含量降低可能是由于3－1Y较低的发酵活力导致糖酵解产生的丙酮酸无法高效氧化为乙醇，而是通过其它途径转化为乙酰－COA、乙酸和乳酸，导致混合发酵的糯米酒中总酸含量增高，并间接抑制其代谢副产物如高级醇的合成［17］，故需要进一步的试验研究验证.

酯是一类具有特殊香味的有机化合物.主要包括脂肪酸乙酯和乙酸酯，它们能赋予酒体独特的风味，尤其是水果味和花香味［18］.比较混合发酵与SJ4单菌种发酵，糯米酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量分别由SJ4单菌种发酵时的45.7mg／L，0.46mg／L显著增加至221.9mg／L，427.3mg／L，这2种物质的提高对改善液态发酵糯米酒的口感和风味有重要作用.乳酸乙酯主要带来类似菠萝香甜味的乙酯，能赋予糯米酒水果香味；具有类似香蕉味的己酸乙酯含量在混合发酵中仅提高了5.6％，增量不明显，但丁酸乙酯含量却由原来的154.5mg／L降至72.5mg／L.混合发酵的糯米酒中总低级酯含量达到733mg／L是SJ4单菌种发酵时的3.47倍，明显改善了糯米酒的风味.

表3　单一和混合发酵糯米酒中风味物质含量Tab.3 Content of flavor com pounds in different yeast inoculation ways to ferment glutinous rice wine mg／L

2.3主成分分析法分析混合发酵过程中风味物质代谢

主成分分析（principal component analysis，PCA）也称主分量分析，该方法利用降维的思想，将多指标的变量通过线性变换、计算特征值等转化成少数几个综合指标的数理统计方法［19］.如表4及续表4所示，混合发酵过程中糯米酒中9种主要风味物质含量，在Minitab 15分析软件中运用统计菜单下的主成分分析进行数据统计，得到特征值、贡献率、累计贡献率、载荷表（表5）和分值图（图2）.

表4　混合发酵过程中糯米酒风味物质含量Tab.4 Content of flavor compounds during the mixed fermentation mg／L

续表4　混合发酵过程中糯米酒风味物质含量Continued Tab.4 Content of flavor com pounds during the mixed fermentation mg／L

由分析结果可知：第一主成分（PC1）所占比率为38.4％，第二主成分（PC2）所占比率为27.2％，第三主成分（PC3）所占比率为14.8％，3个主成分的累计贡献率为80.4％，分析结果可靠；在主成分分析中，载荷绝对值越大表示该项目与该主成分间的相关性越大，正负值分别代表正负相关，由表5可知，对第一主成分影响较大的依次为己酸乙酯、异丁醇，对第二主成分影响较大的依次为仲丁醇、丁酸乙酯、乳酸乙酯、异戊醇，对第三主成分影响较大的依次为正丙醇、甲醇.

表5　混合发酵过程中主要风味物质载荷表Tab.5 Load table of flavor compounds during the mixed fermentation

由3D分值图（图2）可知，发酵102 h的糯米酒PC1值最高，为3.09，发酵66 h的PC2值最高为2.24，发酵19 h的PC3值最高为1.96.计算各发酵时间段的相对贡献率（PC1×PC2×PC3）绝对值大小，分别为2.5879，1.008 9，2.2623，0.0383，1.6887，5.1039,0.1908，0.03675，0.5679，0.921 7，得出发酵54 h的糯米酒相对贡献率最大为5.103 9，表明在发酵54 h的这段时间内，酵母细胞中风味物质的代谢活动最为旺盛.

3　结论

注：0～9分别代表发酵时间点：0 h，9 h，19 h，29 h，42 h，54 h，66 h，78 h，90 h，102 hNote：0～9 respectively represent fermentation time：0 h，9 h，19 h，29 h，42 h，54 h，66 h，78 h，90 h，102 h

通过对扣囊复膜酵母和酿酒酵母混合液态发酵改善糯米酒风味物质的研究，初步了解到2种酵母混合发酵的特点.结果表明：混合发酵与SJ4单菌种发酵相比，糯米酒的酒精度及残糖量差异不显著（P＞0.05），但混合发酵能提高糯米酒中总酸和氨基态氮含量.除此之外，混合发酵还能显著改变糯米酒中的风味物质，不仅降低了对人体有害的甲醇、异丁醇、异戊醇的含量，同时合成更多低级酯，有效改善了糯米酒的质量和风味.PCA（主成分分析）分析得出混合发酵54 h左右的时间段是酵母次级代谢最为活跃、风味物质合成活性最高的时候，可在此段时间前加入微生物营养物质，如碳源、氮源、微量元素等来进一步改善糯米酒中风味物质含量.

［1］杨莹，徐艳文，薛军侠，等.葡萄酒相关酵母的香气形成及香气特征［J］.微生物学通报，2007，34（4）：757-760.

［2］ROJASV，GIL JV，PIÑAGA F，et al.Acetate Ester Formation in Wine by Mixed Cultures in Laboratory Fermentations［J］.International Journalof Food Microbiology，2003，86（1）：181-188.

［3］ROJASV，GIL JV，PIÑAGA F，et al.Studies on Acetate Ester Production by non-Saccharomyces Wine Yeasts［J］.International Journal of Food Microbiology，2001，70（3）：283-289.

［4］ZIRONI R，ROMANO P，SUZZI G，et al.Volatile Metabolites Produced in Wine by Mixed and Sequential Cultures of Hanseniaspora guilliermondii or Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae［J］.Biotechnology Letters，1993，15（3）：235-238.

［5］王慧，张立强，刘天明，等.产地葡萄酒优良酵母菌株的筛选及鉴定［J］.酿酒科技，2007（9）：29-31.

［6］唐洁，王海燕，徐岩.酿酒酵母和异常毕赤酵母混菌发酵对白酒液态发酵效率和风味物质的影响［J］.微生物学通报，2012，39（7）：921-930.

［7］李景明，于静，吴继红，等.不同酵母发酵的赤霞珠干红葡萄酒香气成分研究［J］.食品科学，2009，30（2）：185-189.

［8］易弋，伍时华.酒精耐受性酵母菌的筛选［J］.广西工学院学报，2008，19（3）：42-46.

［9］应玲云.酒曲中真菌的筛选、鉴定与糯米酒纯菌种液态法酿造工艺的研究［D］.柳州：广西科技大学，2013.

［10］何晶晶.丝状真菌的筛选鉴定及糯米酒液态酿造试验［D］.柳州：广西科技大学，2014.

［11］赵子威，伍时华，张健，等.不同总糖浓度木薯全渣乙醇分批发酵过程的研究［J］.广西科技大学学报，2014，25（3）：92-97，102.

［12］全国食品工业标准化技术委员会酿酒分技术委员会.GB／T 13662-2008黄酒［S］.北京：中国标准出版社，2009.

［13］汪建国.浅谈黄酒中有机酸的特征和功能［J］.中国酿造，2008，191（14）：81-83.

［14］陈靖显.论黄酒中氨基酸态氮含量的相关因素［J］.食品与发酵工业，1992（2）：83-88.

［15］毛青钟，石彩琴.黄酒中主要上头物质及控制技术的研究［J］.江苏调味副食品，2010，27（3）：17-21.

［16］潘荣春.黄酒中甲醇含量的检测［J］.苏州医学院学报，1997，17（4）：798.

［17］BELLS J，HENSCHKEPA.Implications of Nitrogen Nutrition for Grapes，Fermentation and Wine［J］.Australian Journal of Grape and Wine Research，2005，11（3）：242-295.

［18］HAZELWOOD LA，DARAN JM，VANMARISA J，et al.The Ehrlich Pathway for Fusel Alcohol Production：A Century of Research on Saccharomyces cerevisiae Metabolism［J］.Applied and Environmental Microbiology，2008，74（8）：2259-2266.

［19］王琨，伍时华，赵东玲，等.霉菌复合菌株对糯米酒风味物质的影响［J］.酿酒科技，2015，254（8）：28-32.

（学科编辑：黎娅）

Research of mixed fermentation of saccharomycescerevisiae and saccharomycopsis fibuligera to improve flavor com pounds in glutinous rice wine by liquid fermentation

YANG Zi-lin1,WU Shi-hua*,HUANG Cui-ji,YI Yi
(School of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006,China)

To improve the taste of glutinous rice wine fermented with S.cerevisiae single strain by mixing 3-1Y and SJ4,this paper compared the differences between mixture fermentation and pure fermentation of S.cerevisiae.Flavor substances content in glutinous rice wine were analyzed by PCA(principal component analysis).The results showed:by comparing mixed fermentation and pure fermentation of SJ4,total acid and amino nitrogen content in mixed fermentation were increased by 17.3％,19.8％respectively;the contents of Methanol,isoamyl alcohol and isobutanol in glutinous rice wine were reduced from 417.4mg/L,321.3 mg/L,4.4 mg/L to 23.6 mg/L,1.3 mg/L, 0.047mg/L respectively;the lower esters content was3.47 times as much as pure culture of SJ4 increase to 733mg/ L.The synthesis activity of flavor substances reaches its maximum at about 54h in the mixed fermentation which provide a theoretical basis to further improve the glutinous rice wine flavor.

glutinous rice wine;mixed fermentation;flavor compounds;principal components analysis

TS261.1

A

2095-7335（2016）03-0095-06

10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2016.03.017

2016-04-14

广西科技攻关项目（桂科攻0782003-2）资助.

＊伍时华，博士，教授，研究方向：发酵工程，E-mail：974499054＠qq.com.