吐鲁番黑羊导入策勒黑羊多胎基因（FecB）的初步研究

古丽格娜，蒋晓梅，艾买提·买买提，史洪才，牛志刚，储明星

（1.新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830000；2.新疆托克逊县地方国营牧场，托克逊 838100；3.新疆畜牧科学院生物技术研究所，乌鲁木齐 830000）

吐鲁番黑羊导入策勒黑羊多胎基因（FecB）的初步研究

古丽格娜1，蒋晓梅1，艾买提·买买提1，史洪才2，牛志刚2，储明星3

（1.新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830000；2.新疆托克逊县地方国营牧场，托克逊 838100；3.新疆畜牧科学院生物技术研究所，乌鲁木齐 830000）

以592只吐鲁番黑羊与策勒黑羊杂交一代羊为实验群体，采用PCR-RFLP技术分析了FecB基因的多态性。结果表明：吐鲁番黑羊导入策勒黑羊血液后，杂交一代个体中出现BB、B+和++三种基因型，其基因型频率分别为0.181、0.411、0.408；B、+两种等位基因频率分别为0.615、0.385；经χ2检验，吐鲁番黑羊导入策勒黑羊血液后，杂交一代群体在FecB基因位点上均处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P＜0.01），且该位点上呈现出中度的多态性（PIC=0.362）。研究结果提示，FecB基因能够作为吐鲁番黑羊与策勒黑羊杂交育种多胎性能的候选基因，为多胎羊分子育种研究提供理论依据。

吐鲁番黑羊；策勒黑羊；FecB基因

吐鲁番黑羊是以生产优质羔羊肉和羔皮为主的优良新疆地方绵羊品种之一，也称托克逊大尾黑羊，其主要产区位于吐鲁番地区托克逊县［1］。吐鲁番黑羊具有适应夏季酷热、冬季严寒、多风沙的吐鲁番盆地气候；能耐受粗纤维多、木质化强、多刺、耐盐碱抗干旱的牧草植物，且能快速增膘和生长迅速等特点。吐鲁番本地大尾羊，角短、大尾脂、粗毛，被毛颜色栗、黄、花、黑不一，是以短脂尾蒙古系巴音布鲁克大尾羊为父本，以肥臀型哈萨克羊为母本的杂交后代。20世纪60年代，吐鲁番地区引进库车羔皮羊卡拉库尔羊杂交改良吐鲁番本地大尾羊，经多年自群繁育，杂交后代既保持了原本地羊大尾脂的特征，同时又遗传了库车羔皮羊黑色被毛的特征，最终形成了遗传特征基本稳定的吐鲁番黑羊，深受当地群众的喜爱［2］。

FecB基因位于绵羊6号常染色体，对绵羊的排卵率及产羔数有较大影响［3-4］。该基因实际为骨骼形态发生蛋白IB型受体基因（bonemorphogenetic protein receptor IB，BMPR-IB）。在澳大利亚多胎绵羊品种Booroola羊中BMPR-IB基因编码序列中有1个A746G突变，正是这个突变（Q249R）与Booroola母羊的高繁殖力密切相关，导致携带该突变基因的绵羊产羔数增加［5-6］。

策勒黑羊是新疆以产羔皮为主的多胎优良地方绵羊品种，其主要产区位于塔克拉玛干大沙漠南缘、昆仑山北麓的策勒县，全年发情和繁殖率高是其突出的品种特征［7-8］。本研究紧密结合新疆策勒黑羊高繁品系的育种现状，应用国内外羊多胎基因研究成果，通过地方品种的杂交，研究吐鲁番黑羊群体导入策勒黑羊公羊血液后，杂交一代羔羊群体中FecB基因与高繁殖力之间的相关性，以期为指导高繁品系选育，加快育种进程提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

在新疆吐鲁番地区吐克逊县地方国营牧场采集策勒黑羊与吐鲁番黑羊杂交一代90日龄羔羊血样592份。颈静脉采血5 mL/只，用肝素钠抗凝，-20℃冻存。

1.2主要试剂

Taq DNA聚合酶、dNTP购于北京天根生物技术有限公司，限制性内切酶AvaⅡ、DNA Marker等购自BBI公司（加拿大）。

1.3方法

1.3.1基因组DNA的提取 采用常规酚氯仿抽提法从抗凝血中提取基因组DNA，用紫外分光光度计测定基因组DNA浓度和纯度，稀释DNA样品至50 ng/μL左右，置-20℃冰箱中备用。

1.3.2引物设计根据绵羊FecB基因的突变位置，在引物上引入一个错配碱基，与该突变位点形成一个AvaⅡ的酶切位点。引物由上海生工生物工程公司合成。

表1　FecB基因引物序列

1.3.3PCR-RFLP检测对策勒黑羊与吐鲁番黑羊杂交一代90日龄羔羊血样的基因组DNA进行PCR扩增。PCR扩增反应体系：10×Buffer 2 μL，10 μmol/L上下游引物各1μL，10mmol/LdNTP2 μL，25mmol/LMg2+1.5μL，50 ng/μL左右的DNA模板1 μL，2.5 U/μLTaq DNA聚合酶0.5 μL，加去离子水至总体积为20 μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，62℃退火40 s，72℃延伸30 s，共35个循环；最后72℃延伸7 min，4℃保存。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

用限制性内切酶AvaⅡ对PCR产物进行酶切，酶切反应体系：10×缓冲液1 μL，PCR反应产物为4 μL，10 U/μLAvaⅡ内切酶为0.8μL，加去离子水至总体积10μL。酶切反应条件：37℃水浴6 h，反应结束后取5 μL产物加样于3%琼脂糖凝胶电泳检测和判读酶切结果。

1.3.4数据处理用Picalc程序包计算多态信息含量（用以估计标记基因的多态性，PIC＞0.5则该标记呈现高度多态，0.25＜PIC＜0.5呈现为中度多态，PIC＜0.25呈现为低度多态）；用PopGene32软件计算基因型频率、等位基因频率、基因纯合度（Ho）、基因杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）及多态信息含量（PIC）。

2　结果与分析

2.1FceB基因多态位点的PCR-RFLP扩增结果

本实验以策勒黑羊与吐鲁番黑羊杂交一代90日龄羔羊的基因组DNA为模板进行扩增后，得到了预期的目的片段，大小为141 bp，见图1。

AvaⅡ限制性内切酶消化PCR产物后，出现3种带型：++基因型为141 bp，B+基因型为141 bp和111 bp，BB基因型为111 bp。30 bp迁移到凝胶外，观察不到，但不影响结果判定，见图2。

图2　FecB酶切电泳图

2.2FecB基因多态位点的等位基因频率和基因型频率

对策勒黑羊与吐鲁番黑羊杂交一代90日龄羔羊群体进行FecB基因突变的多态性检测，检测到突变纯合子（BB）107只、突变杂合子（B+）243只、未发生突变（++）个体242只。基因型频率及等位基因频率见表2。

表2　吐鲁番黑羊导入策勒黑羊血液杂交一代90日龄羔羊FecB基因型频率及等位基因频率

2.3Hardy-Weinberg平衡状态检验

遗传杂合度（He）和多态信息含量（PIC）是衡量群体遗传变异和遗传多态性的合适参数。不同的遗传参数体现出各群体其遗传上的本质差异。从表3看出，吐鲁番黑羊导入策勒黑羊血液后，杂交一代90日龄羔羊群体的FecB基因序列的多态信息含量（PIC）为0.362，属于中度多态，即吐鲁番黑羊导入策勒黑羊血液，杂交一代90日龄羔羊群体遗传变异处于中等水平。

表3　吐鲁番黑羊导入策勒黑羊血液杂交一代90日龄羔羊群体FecB基因遗传参数

3　讨论

近年来，国内外研究者在关于绵山羊多胎基因分子标记研究方面取得了一定的进展。作为绵羊高繁殖力的第1个主效基因，FecB基因首次在澳大利亚Booroola Merino绵羊中被发现。1993年，Montgomery等［9］首先发现，FecB基因与微卫星基因座OarAE101和OarHH55紧密连锁，遗传距离分别为13 cM和20 cM。1994年，Montgomery等［5］又采用连锁分析法将FecB基因定位到OarAE101和EGF（表皮生长因子）/IF（补体因子1）之间的区域，趋向于绵羊6号染色体的着丝粒。1998年，Lord等［6］通过在EGF与微卫星标记OarAE101之间加入2个微卫星基因座McM53和OarJL1A以及1个基因座着丝粒自身抗原E，进一步将FecB基因精确定位在绵羊6号染色体着丝粒区的微卫星标记OarAE101和BM1329之间的10 cM区间内。2001年，Mulsant等［10］将FecB基因定位于该区域微卫星基因座471 U和300 U之间小于1 cM的区间内，而微卫星BMS2508和LSCV043为位于FecB基因区域两端最近的标记，遗传距离分别为1.5 cM和2.3 cM，微卫星基因座GC101则位于FecB基因突变区内；在Booroola绵羊的回交群体中检测到471 U的3个等位基因。2006年，殷子惠等［11］首先在小尾寒羊中分析了FecB基因与微卫星标记Oar J L36的连锁关系，结果显示FecB基因B等位基因与Oar J L 36之间仍然存在重组，但其研究群体仅为72只BB型的小尾寒羊，具有一定的局限性。2007年，管峰等［12］在101只湖羊中检测到471U的3个等位基因，471U的PIC为0.405；湖羊微卫星基因座 471 U的 196/200、200/200、200/204和204/204基因型之间的产羔数均无显著差异（P＞0.05）。

本实验对吐鲁番黑羊导入策勒黑羊血液后，杂交一代90日龄羔羊群体的FecB基因突变多态性检测结果表明，突变杂合子（B+）和未发生突变（++）基因型是主要基因型，基因型频率分别为0.411和0.408；等位基因以B等位基因占优势，占群体的61.5%，+等位基因频率为38.5%。B＋基因型（杂合子）的出现说明品种改良杂交新品种群也存在与Booroola Merino羊相同的突变位点，此结果与史洪才等［13］将BMPR-IB基因作为新疆多浪羊多胎性能候选基因的研究结果相近。在实际生产过程中，可以根据携带FecB突变的情况开展选种选配，指导吐鲁番黑羊肉用绵羊高繁品系的选育，为加快新品种的育种进程提供理论依据。由本研究结果可知，吐鲁番黑羊导入策勒黑羊血液后，杂交一代群体基因频率分布处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P＜0.01），这可能与检测过程中公母羊比例以及选择有关，另一方面也可能与样本量少有关。

4　结论

本研究首次分析了FecB基因在吐鲁番黑羊导入策勒黑羊血液后，杂交一代90日龄羔羊群体中的遗传多态性，检测到了FecB基因存在BB、B+、++三种基因型，B、+两种等位基因。研究结果提示，FecB基因存在于吐鲁番黑羊与策勒黑羊杂交一代羔羊群体中。

致谢：感谢新疆托克逊国营牧场伊力哈木等工作人员在血样采集和资料收集过程中给予的大力支持和帮助。

［1］ 王兆平，张海晓.吐鲁番黑羊［J］.中国畜禽种业，2008（17）：27.

［2］ 海尼木古力·艾合买提，努尔拜合提.吐鲁番黑羊品种保护及发展对策［J］.畜牧兽医科技信息，2008（9）：95-96.

［3］ Souza CJ.The Booroola（FecB）phenotype is associated with a mutation in the bone morphogenetic receptor type 1 B（BMPR1B）gene［J］. Endocrinol，2001，169（2）：1-6.

［4］Mcnatty K P，Smith P，Hudson N L，et al.Development of the sheep ovary during fetal and early neonatal life and the effect of fecundity，genes［J］.Journal ofReproduction and FertilitySupplement，1995，49：123-135.

［5］ Montgomery G W，Lord E A，Penty J M，et al.The Booroola fecundity（FecB）gene maps to sheep chromosome 6［J］.Genomics，1994，22：148-153.

［6］Lord E A，Davis G H，Dodds K G，et al.Identification of Booroola carries using microsatellite markes［J］.Wool Technology and Sheep Breeding，1998，46：245-249.

［7］ 于大新，阿里木江·苏力唐，张奇琨，等.新疆家畜家禽品种志［M］.乌鲁木齐：新疆人民出版社，1985.

［8］ 祁成年，谢安新，胡文兵，等.策勒黑羊的品种特性与保护利用［J］.塔里木大学学报，2006，18（2）：32-33，63.

［9］ Montgomery G W，Crawford A M，Penty J M，et al.The ovine Booroola fecundity gene（FecB）is linked to markers from a region of human chromosome 4q［J］.Nature Genetics，1993，4（4）：410-414.

［10］MulsantP，LecerfF，FabreS，etal.Mutationin bonemorphogeneticprotein receptor-IB is associated with increased ovulation rate in Booroola Merino ewes［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of USA，2001，98（8）：5104-5109.

［11］殷子惠，姜运良，樊新忠，等.小尾寒羊BMPR-IB基因的多态性、效应及连锁分析［J］.畜牧兽医学报，2006，37（5）：510-513.

［12］管峰，石国庆，艾君涛，等.湖羊6号染色体微卫星标记多样性与产羔数的关系［J］.遗传，2007，29（10）：1230-1236.

［13］史洪才，武坚，朱二勇，等.BMPR-IB基因作为新疆多浪羊多胎性能候选基因的研究［J］.中国草食动物，2006，26（2）：12-14.

S826.2

A

2095-3887（2016）01-0009-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.01.003

2015-12-08

新疆维吾尔自治区科技援疆项目（2013911056）

古丽格娜，女，副研究员。

储明星，男，研究员，博士，博士生导师。