婴幼儿配方乳粉中乳清蛋白含量测定方法

文/赛音呼格吉乐　于景华*（天津科技大学）

婴幼儿配方乳粉中乳清蛋白含量测定方法

文/赛音呼格吉乐于景华*
（天津科技大学）

乳清蛋白具有独特的生物学功能，是重要的蛋白来源。为此综述了国内外关于婴幼儿配方乳粉中乳清蛋白含量测定的方法以及相关乳制品中乳清蛋白含量的测定方法。

婴幼儿配方乳粉；乳清蛋白；含量测定

乳清蛋白作为婴幼儿生长发育过程中重要营养成分，比酪蛋白具有更高的营养价值，并且更容易被人体消化吸收。母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例为60︰40[1]，而牛乳中的蛋白质组成与人乳相比具有较大的差异，其中乳清蛋白与酪蛋白的比例约为20︰80。为了使以牛乳为原料的婴儿配方乳粉更接近母乳，为婴儿提供更利于其生长的营养，可适当添加符合相关规定的乳清粉或乳清蛋白粉作为营养强化剂。我国国家标准GB 10765-2010《婴儿配方食品》[2]中有相关要求，即婴儿配方食品中乳清蛋白含量应大于60%。热处理是食品加工过程的必要手段，乳清蛋白中主要功能性组分α-乳白蛋白和β-乳球蛋白等会在这些热处理过程中发生变性，而热处理的时间和温度会导致这些组分发生不同程度的变性，通常这些变性是影响乳品中乳清蛋白品质的重要因素，会影响其活性，降低其营养价值，并且对婴幼儿的消化吸收造成不利影响[3]。因此，需要一个高效、准确并且适用于婴幼儿配方乳粉的测定方法来为其有效的营养价值提供参考依据和检测方法。目前，国内外关于乳清蛋白定量检测方法的报道有很多，其中不乏一些新的方法和对旧方法的改进。因此，有必要总结多种乳清蛋白检测方法，评价其优缺点，为今后优化检测方法提供基础。

1　SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳法

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）用于分离蛋白质和寡核苷酸时具有良好的效果，近些年被广泛用于分离乳清蛋白。十二烷基硫酸钠（SDS）是一种很强的阴离子表面活性剂，可以与蛋白质通过疏水相互作用结合。不同的蛋白质在具有分子筛效应的凝胶中发生迁移，从而实现彼此分离。该方法能有效地分离α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。目前我国国家标准GB/T 5413.2-1997《婴幼儿配方食品和乳粉乳清蛋白的测定》[4]中就是采用了SDS-PAGE法。具体方法是：首先将凝胶放入电泳槽中，再加入缓冲液，试样溶液与标准溶液的添加量为每孔10 μL，以10%～20%的梯度复合凝胶进行电泳，电流为40 mA，时间为60 min。酪蛋白与乳清蛋白会按分子量的顺序分离开，采用光密度计对其进行测定，求得其颜色深度（OD）的积分值（=Trace值）。通过3 种酪蛋白（α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白）谱带的Trace值计算出酪蛋白的比率，以及采用同样的方法计算出乳清蛋白的比率[4]。

国标法对仪器设备的要求比较高，张杉等采用了普通的扫描仪和Bandscan软件[5]。具体方法是：把实验得到的凝胶进行扫描，用该软件分析其条带的灰度值，并通过灰度值和浓度之间的关系对电泳结果进行定量分析，在一定的浓度范围内样品的总灰度值和样品浓度之间存在着线性关系[5]。而贾宏信等认为国标法存在一定的缺陷，因为不同的蛋白质结合考马斯亮蓝的能力不同，因此相同浓度的不同蛋白质会表现出不同的光密度值，从而导致检测结果的准确度较低，误差较大。因此，他们采用ChemiDoc XRS+成像系统的Quantity One图像处理软件处理图像，得出不同蛋白条带总的Trace值，然后计算乳粉内乳清蛋白占总蛋白的比例[6]。

不难看出，聚丙烯酰胺凝胶电泳法对α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分离效果显著，然而对β-乳球蛋白的2 种遗传变异体β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B并不能进行有效的分离。

2　氨基酸折算法

氨基酸是组成蛋白质的基本结构单位，人体摄入蛋白质后会使其分解成氨基酸从而吸收利用；Association of Official Analytical Chemists（AOAC）标准起草人Wesley 等提出采用氨基酸模式来定量计算乳基婴幼儿配方食品中乳清蛋白百分比[7]。AOAC关于乳基婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白的检测标准是根据乳清蛋白和酪蛋白中的4种特征氨基酸，即天冬氨酸/天冬酰胺（Asx）、丙氨酸（Ala）、苯丙氨酸（Phe）和脯氨酸（Pro）的含量折算出婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白的百分比[8]。计算公式如下：

式中：R—特征氨基酸的比值；fw（%）—乳清蛋白百分比。

李爽等对氨基酸折算法计算婴幼儿配方乳粉中乳清蛋白含量的方法进行了分析评价。结果表明，该氨基酸折算法对婴幼儿配方乳粉中乳清蛋白含量的定量研究具有参考价值。然而添加大豆分离蛋白实验的结果表明，添加大豆分离蛋白可明显改变氨基酸组成，说明该氨基酸折算法评价婴幼儿配方粉中乳清蛋白含量的方法只适用于乳基婴幼儿配方乳粉，对含有豆基配方粉的产品不适用[9]。

3　高效液相色谱法

高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析[10]。赵海霞等采用C8色谱柱，流动相A为0.1%的三氟乙酸-水溶液，流动相B为0.09%的三氟乙酸-乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.8 mL/min，二极管阵列检测器的检测波长为215 nm，柱温为30 ℃[11]。外标法定量，α-La和β-Lg两种组分线性关系良好，相关系数分别为0.9998和0.9984，检测限分别为3 μg/mL、10 μg/mL，为定量测定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量提供有效方法[11]。

近年来反相液相色谱作为新兴的色谱分离技术，其机理得到了深入的研究。在乳清蛋白测定方面反相液相色谱的应用也越来越广泛。李慧等应用RP-HPLC在乳清蛋白中分离出α-乳白蛋白和β-乳球蛋白[12]。而王浩等采用RP-HPLC法在乳品中分离出7种蛋白质[13]。朱鑫鑫等采用RPHPLC法分离出BSA、α-La、β-LgB和β-LgA 4 种乳清蛋白成分，并且可以定量测定出未变性的乳清蛋白[14]。但是在此之前要将变性的乳清蛋白和酪蛋白去除，采用的方法是以盐酸为pH值调节剂，用等电点沉淀法除去变性的乳清蛋白和酪蛋白[14]。以此方法可以检测出乳清蛋白组分之间变性程度的差异和各种产品之间乳清蛋白量浓度的差异，可以为脱脂乳及脱脂乳粉中乳清蛋白成分的定性和定量提供可靠的测量方法。

由于常用的高效液相色谱柱填料的直径为5 μm，导致需要花费较长时间来分离目标产物，因此超高效液相色谱技术（UHPLC）得以应用。UHPLC色谱柱填料的直径降低为1.7～5.0 μm，固定相的粒径越小，理论塔板高度越小，柱效也就越高[21]。

高效液相色谱法通常是通过紫外吸收来定量的。而蛋白质分子结构非常复杂，容易发生结构变性以及造成分离柱吸附。因此采用高效液相色谱法经常会出现实验结果的回收率低和分离度差等问题，仍需要对实验条件不断地优化来降低误差。

4　液相色谱-质谱联用法（LC-MS）

液相色谱-质谱联用技术是近10 年来兴起的新技术，相比于其它色谱方法，其具有更高的选择性和灵敏度。近年来的一些研究也证明LC-MS技术在蛋白质分析领域具有较高的应用价值。Christoph C等[15]采用LC-MS联用方法测定牛奶和乳制品中β-乳球蛋白的含量。而对于α-乳白蛋白，Ren Yiping等[16]采用UHPLC-MS联用方法进行了测定，同时也可以测出β-乳球蛋白的含量。采用直径1.7 μm的C18色谱柱，而流动相仍然采用0.1%的三氟乙酸水溶液和0.1%的三氟乙酸乙腈溶液[11]。

在此基础上，张京顺[17]应用UHPLC-MS联用技术检测出非变性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，为了降低基质干扰，采用人乳α-乳白蛋白作为内标和空白基质。采用三氟乙酸、乙腈溶液作流动相。在质谱中定量检测时采用选择区间扫描方式，之后对所建立的方法分别进行室内方法学验证，并且对收集到的相关产品进行了分析检测，均获得了较好的结果。

5　毛细管电泳法

毛细管电泳（CE）又称高效毛细管电泳（HPCE），通常采用毛细管作为分离通道在高压电场中进行分离。唐萍等[18]利用毛细管电泳法研究了乳制品中蛋白成分的分离与测定。利用柠檬酸缓冲体系，对牛奶中的α-乳白蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg）、α-酪蛋白（α-CN）、β-酪蛋白（β-CN）、κ-酪蛋白（κ-CN）5 种蛋白进行了很好的分离。杨媛媛等[19]建立了高效毛细管电泳分离乳清蛋白中 α-La、β-LgA和β-LgB的方法，并且加入羟丙基-β-环糊精和聚氧化乙烯（PEO）为分离缓冲溶液来降低内壁吸附。张毅杰[20]采用硼酸盐缓冲体系和自制的聚丙烯酰胺涂层毛细管，在紫外检测波长214 nm，分离电压20 kV条件下，很好地分离了牛奶中α-乳白蛋白（α-La）和β-乳球蛋白（β-Lg）。

对于毛细管电泳法，由于受到进样量和电压的限制，该方法的检测灵敏度较低，从而导致实验的准确性会相对较差一些。同时，毛细管内壁容易吸附碱性蛋白等生物大分子，会导致峰拖尾和展宽，甚至形成不可逆吸附使分离无法进行[19]。

6　其它方法

凝胶色谱（GC）是一种物理性分离方法。其原理是被分离的混合物在通过具有多孔网状结构的凝胶颗粒时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶而从凝胶颗粒之间的空隙间流动，所以被最先洗脱出来；而比凝胶孔径小的分子能不同程度地自由出入凝胶内外空隙，因而迁移的路径变长且速率变慢，最后被洗脱出来[21]。但凝胶色谱分辨率较低，对于分子量差别比较小的蛋白质无法进行有效的分离，例如β-乳球蛋白的2 个遗传变异体β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B，两者之间仅有90 Da的分子量差异，故无法进行有效分离[16]。

毛细管电色谱技术（CEC）是以电渗流为驱动力，同时在毛细管内填充或在内壁涂覆、键合或交联色谱固定相的一种微柱液相色谱技术[21]，近年在多肽和蛋白质的分离和分析上具有较好的表现。但是该技术在乳清蛋白的检测和分析上报道不多，技术也相对不是很成熟。未来在乳清蛋白的分析检测中，可以利用其极佳的分离特性对乳清蛋白各组分进行更好的分离分析。总之，该方法具有非常好的应用前景。

7　总结

综上所述，SDS-PAGE法仅能分离出α-乳白蛋白（α-La）和β-乳球蛋白（β-Lg），并不能对β-乳球蛋白的2 种遗传变异体——β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B进行有效分离。而很多方法对于经过一定加热处理后的样品，由于蛋白质变性，其测定结果与实际含量存在一定的误差。每个方法也都存在一些系统性的缺点，导致实验结果不理想。因此需要在特定的情况下应用相应的方法，例如仅需测定2 种主要乳清蛋白时采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，又或者在测定乳基婴幼儿配方乳粉的乳清蛋白酪蛋白比例时采用氨基酸折算法。高效液相色谱法中反相高效液相色谱法应用较多，尤其是在对非极性和弱极性物质的分离中。而想要让分离时间更短，可采用超高效液相色谱技术。通过采用质谱作为检测系统，可获得相对分子质量以及结构信息。毛细管电泳法较适合少量的样品测定，而对于内壁吸附问题可加入聚氧化乙烯（PEO）以及羟丙基-β-环糊精来获得较好效果。未来仍需不断改良当前的方法，并对毛细管电色谱等新技术掌握越来越成熟，以达到最好的检测效果。C

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国家自然科学基金（31271904）]

赛音呼格吉乐（1989-），男，在读硕士研究生，研究方向为乳品科学与工程。

⋆于景华（1966-），男，教授，博士研究生，研究方向为乳品科学与工程。

（2016-05-05）