香菇挥发性成分SPME-GC-MS分析及特征指纹图谱的建立

陈万超，杨 焱，李 文，蒋 俊，于海龙，冯 杰，李晓贝，刘 昆

（1.国家食用菌工程技术研究中心，农业部南方食用菌资源利用重点实验室，上海市农业科学院食用菌研究所，上海201403；2.上海海洋大学 食品学院，上海201306；3.丽水市农科院 食药用菌研究所，浙江 丽水323000）

香菇挥发性成分SPME-GC-MS分析及特征指纹图谱的建立

陈万超1，2，杨 焱1，李 文1，蒋 俊3，于海龙1，冯 杰1，李晓贝1，刘 昆3

（1.国家食用菌工程技术研究中心，农业部南方食用菌资源利用重点实验室，上海市农业科学院食用菌研究所，上海201403；2.上海海洋大学 食品学院，上海201306；3.丽水市农科院 食药用菌研究所，浙江 丽水323000）

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（SPME-GC-MS）对12个品种香菇挥发性成分进行分析，并结合聚类分析提取出42个共有香气特征成分，构建成香菇特征指纹图谱。同时图谱信息与样品共有峰信息进行相似性分析，得到其良好可靠性，且可设定相似度阈值为0.6来衡量其香气品质，或者甄别与香菇香气的差异程度；依据所建图谱信息，采用主成分分析对其他食用菌样品进行对照研究，显示香菇样品与其他食用菌样品均存在明显差异，表明该特征指纹图谱可用于香菇香气的鉴定和监控。

香菇；气相色谱-质谱联用技术；指纹图谱；主成分分析；挥发性成分

全球香菇（Lentinula edodes）栽培产量仅次于双孢蘑菇（Agaricus bisporus）。香菇的人工栽培在我国已有800多年的历史［1］。中国是世界人工栽培香菇的发祥地，是全球最大的香菇生产与消费大国，并随着栽培技术的不断革新和创新，香菇产量已占到全球香菇总产量的70%以上［1-2］。香菇，不仅富含香菇多糖、香菇嘌呤等活性成分，具备有效调节免疫系统、抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化、降血脂、降胆甾醇等药理作用［2］，而且鲜美可口，风味独特。其具有的浓郁特殊香味，是评价香菇品质的关键指标之一，国内外学者对香菇挥发性物质进行分析［3-7］，认为一些含硫杂环化合物是香菇的特征风味成分，一些八碳化合物具有蘑菇味，而对于具体的风味特征指纹图谱的研究并没见报道。

气味指纹分析技术是在现代仪器分析技术不断进步的推动下快速发展起来的，已经被广泛应用于水果的香气成分、肉类风味、酒类挥发性物质及香精香料风味组分的鉴定［8］。且可采取的仪器手段，如气相色谱-质谱联用 （Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）、气味指纹仪和味觉指纹仪等，能够产生气相色谱指纹图谱、气味指纹图谱和味觉指纹图谱，分别给出样品的结构指纹、气味指纹和口感指纹信息［9］。其中GC-MS是较为常用的方法之一，而与固相微萃取 （solid phase microextraction，SPME）联用具有操作时间短、样品量少、无需萃取溶剂、重现性好等优点［6-7，10］，可全面准确分析香菇风味组成。根据分析结果筛选对香菇风味起决定作用的特征成分，建立其指纹图谱中的特征指纹信息，采用系统聚类、相似度分析法及主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），构建香菇指纹图谱，可为香菇和香菇产品的开发和品质的认证，提供坚实的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

12个品种香菇（L.edodes）如表1所示，均为目前国内的主栽审定品种。菌种由浙江省丽水市农科院食药用菌研究所提供，栽培地浙江丽水。灰树花（Grifola frondosa）、猴头菌（Hericium erinaceus）和鸡腿菇（Copyinds comatus）子实体干品，均购自上海百信生物科技有限公司。

表1 香菇菌种Table 1 L.edodes strains

1.2 试剂与仪器

正构烷烃混合标样（C7—C30），购自上海安谱科学仪器有限公司；邻二氯苯（色谱级），购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇（色谱级），购自美国迪马科技公司。其他试剂均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

SPME萃取装置，75 μm CAR/PDMS（carbon/ polydimethyl siloxane），美国 Supelco公司制造；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司制造；HWS28型电热恒温水浴锅，DHG-9240A型鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司制造；BF00A粉碎机，上海淀久机械制造有限公司制造；Milli-Q超纯水设备，美国Ultra公司制造。

1.3 实验方法

1.3.1 香菇的栽培、样品采样及预处理 12个品种香菇栽培配方（质量分数）为木屑79%，麸皮20%，石膏粉1%；开始栽培时间为2013年8月底，由于出菇时间不同，均采收第二茬香菇作为样本；按照中华人民共和国农业行业标准《NY/T 1061-2006香菇等级规格》选取特级鲜香菇，从菌盖连接处去除菌柄，菌盖于（50±2）℃烘干至含水量低于质量分数10%，将烘干的样品分别粉碎过60目筛后置于干燥器中备用。

1.3.2 顶空固相微萃取（SPME）香菇挥发性物质精确称取1.0 g粉粹的香菇干品，装入15 mL的固相微萃取瓶中，加入5 mL水和10 μL邻二氯苯（96 mg/L），迅速均匀后密封，将萃取瓶放入55℃恒温水浴锅中，待样品温度升至55℃时，将老化的固相微萃取柱头（75 μm CAR/PDMS）插入萃取瓶中，同时推出纤维萃取头，顶空处平衡吸附30 min。吸附后，立即收回萃取头，同时将SPME移至GC进样口内，在250℃下解析10 min。

1.3.3 GC-MS分析条件 GC-MS型号 Agilent 7890A-5975C，采用 DB-5ms毛细色谱柱（J&W Scientific Inc，Folsom，CA，USA，30 m×0.25 mm× 0.25 μm），载气为纯度99.999%氦气，体积流量1.0 mL/min，不分流进样。进样口温度220℃，传输线温度280℃。色谱柱升温方式为程序升温，起始温度为50℃（保持1 min），以10℃/min的升温速度升至280℃（5 min）。质谱条件：离子源为EI源，温度220℃，四级杆150℃，质量扫描范围35～450 u。

1.4 数据统计分析

相似度分析采用Excel 2007软件处理，聚类分析（clustering）和主成分分析（PCA）采用IBM SPSS Statistic 20.0软件处理。

2 结果与分析

2.1 香菇样品SPME-GC-MS分析

为了获取切实的香菇挥发性成分，采用内标物和一系列正构烷烃的混合标样作为参照［11］计算相对保留指数（包括相对保留时间和相对保留面积），对样品中各个峰进行定量和定性分析。本实验各样品SPME-GC-MS分析谱图如图1所示，其选用邻二氯苯作为内标物，根据被测化合物和内标物相应的色谱峰面积之比来计算被测组分的相对含量；并将GC-MS结果导入LECO Chroma TOF软件，选择信噪比（S/N）为100，采用NIST11和Wiley谱库检索，色谱保留指数及人工解析鉴定化合物结构，同时对比C7—C30的正构烷烃混合物测定结果，计算保留指数，进行定性分析；在色谱峰分析过程中删除峰面积低于10 000（浓度过低）者，由上述条件获得香菇挥发性成分的色谱结构。12个品种香菇样品中共检出219种物质，包括20种含硫化合物、14种八碳化合物、32种醛类、27种醇类、13种酮类、13种酸类、17种酯类、8种酚类、1种醚类、32种烃类、15种芳香类（包括1个内标物）、11种呋喃、8种吡咯、4种吡啶、4种吡嗪。

2.2 不同品种香菇特征香气物质聚类分析

实验中由于样品处理等因素会造成香气组成和含量的差异，为了排除差异较大的香菇样品，建立稳定的指纹图谱，从而得到较为标准化的指纹特征图谱信息。实验中采用SPME-GC-MS对香菇挥发性成分进行分析，将各色谱峰的相对含量与样品名称建立矩阵，利用IBM SPSS Statistic 20.0软件结合系统聚类法对样品进行聚类分析，剔除差异较大样品对指纹信息的影响。聚类分析采用组间联接聚类方法，以欧式（Euclidean）距离为量度标准，以Z得分对变量进行标准化处理［12］，从而获得香菇挥发性成分聚类谱系图，聚类分析结果树状图如图2所示。

图1 12个品种香菇GC-MS色谱图Fig.1 GC-MS chromatogram of 12 L.edodes.

由图可以得出，当欧氏距离增至17时，12个香菇样品可被划分为两大类群，类群I包括申香8号、申香10号、武香一号、868、Cr04、庆科20和939，类群II包括241、605、9015、L135和808。上述两大类群相似性分布，除808、868和605没有报道外，其他与香菇菌株遗传亲缘关系的研究结果［13-15］相类似，进一步得出遗传亲缘关系与化学成分相似性存在一定关系，选择不同亲缘距离的香菇菌株能够囊括更准确的香菇指纹信息。挥发性成分聚类图中申香8号和申香10号在最小距离形成两个聚类，表示他们之间的相似性最大。同时由图可知，从整体上看不存在某个偏差较大，即被孤立形成一个类群的情况，因此不存在差异较大样品，在后续指纹信息提取时，12个样品挥发性分析结果均不会对指纹图谱的构建造成较大影响。

图2 香菇挥发性成分聚类树状图Fig.2 Cluster pedigree diagram of active-volatiles of L.edodes

2.3 香菇香气特征指纹图谱的建立

香菇香气是一种复杂的体系，由许多种物质共同作用形成，同时外界的温度、湿度等因素都会对其产生一定的影响。香菇在烘干过程中，会导致氨基酸和肽类的热解、糖和氨基酸或者肽类的相互作用等，这些复杂反应会产生大量挥发性成分，从而影响香菇香气呈现。Caporaso等［16］研究发现，短链脂肪醛（C5—C9）具有特殊的香气，如己醛具有生油脂味，庚醛具有坚果味和水果青香，辛醛具有青果皮香等。通过提取香菇共有的成分，能够得到包含体现香菇香气特征的重要成分。

对挥发性成分分析结果作进一步分析，测定结果3 min前峰型干扰较为明显，因此剔除低保留指数（RI＜900）成分，同时剔除对香气一般没有贡献的烷烃［17］，但保留3种含硫杂环化合物（1，2，4-三硫杂环戊烷；1，2，4，5-四硫杂环己烷和1，2，4，5，7-五硫杂环庚烷）。因为含硫化合物是香菇香气的重要组分［5-7，18］，从而提取样品中剩余共有色谱峰，建立标准化香气特征指纹图谱，如表2和图3所示。从12个香菇品种中共提取出42种共有成分，7种八碳化合物、8种含硫化合物、16种醛类、5种醇类、2种酸类、2种酮类、1种吡啶和1种呋喃，所确定的以上成分可作为香菇特征香气的判别及其质量评价的重要依据。

表2 香菇特征香气活性物质指纹图谱信息Table 2 Information of chromatographic fingerprint of active-odor compounds of L.edodes

续表2

2.4 香菇特征香气指纹信息相似度评价

指纹图谱相似度是指纹图谱信息的整体相关性，常用相关系数 （Correlation）、余弦夹角（Angle cosine）等计算方法［12，19-20］进行分析。为确保所构建指纹信息的可靠性，优先考虑构建样品指纹信息的相似度情况。将所选12个香菇品种样品共有色谱峰的相对含量与构建的指纹谱图信息（表2）做相似度分析，如图4所示，相关系数位于0.57～0.98（＞0.5）之间，余弦夹角位于0.63～0.98之间，说明12个样品共有峰与指纹图谱信息相似性较好，所构建的香气特征指纹图谱信息具有可靠性。在实际应用中，待测样品与指纹图谱信息的相似度应存在某个阈值来衡量其香气品质或者甄别与香菇香气的差异程度，因此本实验结果可以得到一个合适的阈值0.6作为这个衡量标准。

2.5 3种其他食用菌与香菇样品主成分分析

主成分分析 （Principal component analysis，PCA）是一种较为经典的特征抽取和降维技术，可用于大量数据的简化及优化处理，快速实现模式或者关系的可视化识别［12］。本实验依据所构建的香菇特征指纹信息数据（表2），分别对3种其他食用菌（灰树花、猴头菌和鸡腿菇）和12个品种香菇进行分析，采用SPSS软件中因子分析进行PCA分析，如图5所示，以42种香菇共有香气物质为分类变量，对12个香菇样品和3个其他食用菌样品进行分类，其中香菇样品和其他食用菌样品聚集在不同位置，说明其间存在明显差异。

同时PCA分析中主成分1（48.76%）、主成分2（23.81%）和主成分3（15.14%）累计方差贡献率为87.71%（＞85%），能够反映样本原始数据的大部分信息，表示通过PCA分析能较好地区分香菇和其他食用菌，整体上利用所构建的指纹图谱信息，可以使香菇的特征得以呈现。

图3 香菇挥发性成分GC-MS指纹图谱Fig.3 GC-MS fingerprint of volatiles of L.edodes

图4 不同品种香菇样品相似度分析Fig.4 Results of similarity among different strains of L.edodes samples

图5 香菇样品与其他食用菌样品PCA分析Fig.5 PCA plot of the 12 L.edodes samples and 3 other mushroom samples

3 结语

以12个国内审定的香菇品种栽培子实体干燥样本为基础，采用SPME-GC-MS分析技术测定香菇挥发性成分，共检测出219种化合物。对品种和各化合物相对含量进行聚类分析，不存在偏差较大样品，且相似性分布与其遗传亲缘关系类似，因此12个品种数据均可采用，且选择不同亲缘距离的香菇菌株能够囊括更准确的香菇指纹信息。

根据所得的挥发性成分构建了能够反映香菇香气特征的指纹图谱信息，提取具有一定香气特征的共有峰42个，其中含7种八碳化合物、8种含硫化合物、16种醛类、5种醇类、2种酸类、2种酮类、1种吡啶和1种呋喃，其中八碳化合物（如1-辛烯-3-醇、2-辛醇等）、8种含硫化合物（如1，2，4-三硫杂环戊烷、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚等）分别为食用菌和香菇特征物质。12个品种上述共有峰相似度分析结果较好，同时与其他种类食用菌进行主成分分析，能较好地区别香菇与其它种类的食用菌，验证了所构建的香气特征指纹图谱信息具有可靠性和准确性，且可通过设定相似度阈值0.6来衡量其香气品质，甄别香菇风味与其他食用菌的差异程度。

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Analysis of Volatile Components in Lentinula edodes by SPME-GC-MS and Establishment of Fingerprint

CHEN Wanchao1，2，YANG Yan*1，LI Wen1，JIANG Jun3，YU Hailong1，FENG Jie1，LI Xiaobei1，LIU Kun3
（1.National Engineering Research Center of Edible Fungi，Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization（South），Ministry of Agriculture，the People's Republic of China；Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Science，Shanghai 201403，China；2.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；3.Institute of Edible and Medical Fungi，Lishui Academy of Agricultural Science，Lishui 32300，China.）

Volatile components in 12 Lentinula edodes species were analyzed by headspace solid phase micro extraction-gas chromatography-mass spectrometry（SPME-GC-MS），and 42 common aroma components were extracted according to the results of clustering analysis to construct the L. edodes characteristic fingerprints.At the same time，the similarity analysis between fingerprint information and sample common component information was performed，the results turned out to be its good reliability.Furthermore，the similarity threshold can be set as 0.6 to measure the quality of its aroma or the degree of difference from L.edodes odor.Based on the characteristic fingerprints information，samples were compared to other edible fungi by principal component analysis（PCA），and the results showed that the odors between L.edodes and other edible fungi were significantly different，indicating that the aroma characteristic fingerprint can be used to identify and monitor L. edodes aroma.

Lentinula edodes，SPME-GC-MS，fingerprint，principal component analysis（PCA），volatile components

TS 201.2

A

1673—1689（2016）010—1074—07

2015-01-04

上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字（2013）第6—10号）。

*通信作者：杨 焱（1970—），女，新疆乌鲁木齐人，工学博士，研究员，主要从事食药用真菌研究。E-mail：yangyan@saas.sh.cn