高产γ-氨基丁酸酵母菌的筛选、鉴定及优化

肖 婧，徐亚男，李 琦，张彦位，刘 研，史学伟*

（1.石河子大学 信息科学与技术学院，新疆 石河子832000；2.石河子大学 食品学院，新疆 石河子832000）

高产γ-氨基丁酸酵母菌的筛选、鉴定及优化

肖 婧1，徐亚男2，李 琦2，张彦位2，刘 研2，史学伟*2

（1.石河子大学 信息科学与技术学院，新疆 石河子832000；2.石河子大学 食品学院，新疆 石河子832000）

从新疆特色食品中筛选出能产γ-氨基丁酸的酵母菌菌株，并对其发酵条件进行优化。采用非酿酒酵母菌分离纯化的方法分离出非酿酒酵母菌，再通过初筛、复筛及诱变挑选出高产γ-氨基丁酸的菌株，并对其进行形态学及26S rRNA基因分析，最后对菌株产γ-氨基丁酸的发酵条件进行优化。经26S rRNA基因序列分析鉴定为葡萄汁有孢汉生酵母XYN019（H.uvarum XYN019）；通过紫外诱变产量提高了2.3倍，最佳诱变时间为30 s，诱变浓度为10-5；优化后的理论发酵条件为培养温度33.95℃，pH值5.01，培养时间49.17 h，接种量为体积分数3.17%，其γ-氨基丁酸质量浓度达到4.926 g/L。以上结果表明，该菌株可作为γ-氨基丁酸产生菌，具有较好的γ-氨基丁酸生产潜力。

γ-氨基丁酸；分离筛选；鉴定；非酿酒酵母菌

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）又称氨酪酸，是一种天然存在的非蛋白质功能性氨基酸［1］，是哺乳动物中枢神经系统中一种重要的抑制性神经递质［2］。GABA具有多种生理功能，如参与抗心律失常、降血压［3-4］、改善脑机能、抑制神经递质［5］、调节心血管［6-7］、增强记忆、镇静安神［8］、活化肝肾。自然界中，GABA广泛存在于动植物和微生物中，但其在动物和植物中含量较低，不容易被提取，因此微生物发酵是目前生产GABA的主要方式。其中产GABA的菌株主要有乳酸菌、大肠杆菌和酵母菌等。

虽然发酵γ-氨基丁酸所用菌种中最为常见的是大肠杆菌，但大肠杆菌在安全卫生方面存在极大隐患，制约了γ-氨基丁酸的生产和开发。己有研究发现，一些高安全的微生物，如乳酸菌、酵母菌、曲霉等也具有GAD（谷氨酸脱羧酶）活性，可以进行GAD的提取和GABA的生产，但均存在γ-氨基丁酸的产量不高等问题。酵母菌因其安全性较高，并且具有较高的营养价值而被广泛应用于食品等工业。酵母菌与食品工艺的关系密切，因此筛选高产GABA的酵母菌菌株具有较高的经济效益［9］。通过诱变的方法选育出高产γ-氨基丁酸的酵母菌株，进行γ-氨基丁酸的发酵生产，具有重要的意义［10］。

本试验中通过紫外诱变的方法辅助筛选高产γ-氨基丁酸酵母菌产生菌株，确定其最优化发酵条件。以便作为食品添加剂原料或直接应用于生产当中，为工业化生产γ-氨基丁酸提供了基础条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 新疆石河子张裕苹果园腐烂苹果，新疆维吾尔族人自制奶酪，新疆石河子张裕葡萄园葡萄表皮及葡萄园土壤。

1.1.2 培养基

赖氨酸培养基（g/L）：赖氨酸5.6，葡萄糖10.0，KH2PO41.0，MgSO400.5，琼脂 20.0，121℃灭菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基 （g/L）：酵母浸粉10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0。

γ-氨基丁酸筛选培养基（g/L）：酵母浸粉10.0，蛋白胨20.0，琼脂20.0，葡萄糖20.0，溴甲酚绿0.001，乙醛酸0.02，琥珀酸0.02。

1.1.3 仪器 Seven Excellence S400型pH计，梅特勒托利仪器（上海）有限公司制造；SYQ-DSX-280B手提式不锈钢电热蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂制造；Mini-14K高速离心机，上海昨非实验室设备有限公司制造；数显气浴恒温振荡器，金坛市精达仪器制造厂制造；Power Cycler Gradient SL PCR仪，德国耶拿分析仪器股份公司制造；IEF-SYS琼脂糖凝胶电泳仪，英国 Biochrom有限公司制造；LC98I-3A氨基酸分析仪，苏州华美辰仪器设备有限公司制造。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离纯化 样品经破碎后进行自然发酵，发酵启动后在整个发酵过程中定期取样，以不同浓度梯度涂布于赖氨酸培养基，28℃培养48 h，划线分离；重复多次直至得到单菌落后，接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，28℃培养48 h后，保存于-80℃冰箱。

1.2.2 菌株筛选 活化菌株按体积分数5%接种量接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，28℃，200 r/min摇床培养 48 h后涂布于筛选培养基，28℃培养3 d，观察菌落颜色，能产生GABA菌株的菌落显绿色，挑选绿色单菌落保存，备用。

1.2.3 菌株诱变 先开启紫外灯，预热20 min以稳定光源。取5 mL不同稀释度的菌悬液置于6 cm无菌空培养皿中。将培养皿放置于磁力搅拌器上，在18 W的紫外灯下，距离25 cm处，打开皿盖，在搅拌状态下分别照射不同时间。各取0.1 mL菌液于试管中，且试管立即放置在冰浴上 l～2 h，低温条件下细胞内参与突变的各种酶活性受到抑制，使修复难以进行。取0.1 mL涂布于酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基平板上，每个稀释度做3个重复，28℃避光培养，3 d后统计菌落总数，取平均值，以未经诱变的平板上的菌落数作为参照，计算致死率。

式 （1）中：D为致死率，Ta为被处理后的活菌数，Tn是未被处理的活菌数。

1）诱变时间的确定：稀释后的菌液分别紫外照射0、5、10、15、20、25、30 s，取0.1 mL涂布于酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基平板上，计算致死率。

2）诱变浓度的确定：取0.1 mL照射后的菌液梯度稀释，将10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7浓度的菌液0.1 mL用三角玻璃棒涂布于酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基上，然后置于28℃培养箱中保存3 d，计算致死率。

以最佳诱变时间和浓度对产GABA菌株进行诱变，测定诱变前后γ-氨基丁酸质量浓度的变化。

1.2.4 定量定性分析

1）γ-氨基丁酸纸层析定性分析：小烧杯盛有约20 mL展开剂，置于倒置的层析缸中，用塑料薄膜密封，平衡30 min；取层析滤纸一张，在纸的下端距边缘2 cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2 cm作一记号；用微量注射器分别取2 μL菌悬液和γ-氨基丁酸标液，分别点在标记位置上，吹干后再点2次，用线将滤纸缝成筒状。将盛有约20 mL展开剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，将滤纸点样端朝下直立于培养皿中。待溶剂上升15～20 cm时即取出滤纸，喷茚三酮显色；用电吹风吹干滤纸，使各层析斑点显色，观察试验结果。

2）定量分析：将筛选出的菌株发酵液离心后去上清液，加三氯乙酸终止反应后，离心取上清液1 mL，用氨基酸自动分析仪精确测定 γ-氨基丁酸质量浓度。

1.2.5 菌株的分子生物学鉴定 采用酵母基因组DNA提取试剂盒提取试验菌株DNA，以所得DNA基因组为模板，利用ITS1和ITS4为引物扩增ITS区的基因，PCR反应体系参照文献［11］，将扩增产物送到北京三博远志生物技术有限责任公司测序；将ITS序列输入NCBI（美国国家生物信息中心）的GenBank数据库进行比对，分析序列同源性，确定该菌株的分类地位。

1.2.6 高产γ-氨基丁酸酵母菌株发酵条件的优化

1）温度对酵母菌产GABA的影响：分别在培养温度为20、25、30、35、40、45℃下培养72 h，测定发酵液中GABA含量，确定最佳培养温度。

2）pH对酵母菌产GABA的影响：分别在pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5下培养72 h，测定发酵液中GABA含量，确定最佳pH值。

3）接种量对酵母产GABA的影响：分别在接种量为体积分数1%、2%、3%、4%、5%，测定发酵液中GABA含量，确定最佳接种量。

4）培养时间对酵母菌产GABA的影响：分别在培养时间为12、24、36、48、60、72 h，测定发酵液中GABA质量浓度，确定最佳培育时间。

5）响应面法优化发酵条件：在单因素试验结果的基础上，采用四因素三水平的Box-Behnken响应面试验设计方法，以pH、温度、培养时间和接种量为考察因素，以酵母菌产GABA质量浓度为指标进行优化，确定最适培养条件。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

样品经处理后利用非酿酒酵母菌筛选培养基（赖氨酸培养基），分离出78株非酿酒酵母菌，经筛选培养基及纸层析定性分析，得到4株产γ-氨基丁酸酵母菌株。结果见图1、图2。

图1 产γ-氨基丁酸菌株诱变筛选结果（菌落颜色）Fig.1 Screening results γ-aminobutyric acid producing strain mutation

图2 γ-氨基丁酸纸层析分析结果Fig.2 Chromatography paper of GABA

2.2 菌株诱变选育

表1 菌株诱变选育对GABA产量的影响Table 1 Effect of mutation on GABA

经紫外诱变处理后A3、Y16、N3、N8四株菌株的GABA含量明显升高，其中N8菌株含量升高最明显，由此可见，紫外诱变对于菌株GABA产量的增加有明显促进作用。

2.3 单因素试验

2.3.1 温度对酵母菌产γ-氨基丁酸的影响 发酵条件为：250 mL的摇瓶装液量25 mL，接种量体积分数3%，摇床转速200 r/min，pH 7.0。在此条件下将摇瓶分别放在20、25、30、35、40、45℃5个温度梯度下培养72 h。测定发酵液中γ-氨基丁酸质量浓度，结果见图3。

图3 温度对GABA产量的影响Fig.3 Influence of temperature in GABA

由图3可知，随着培养温度的增加，GABA质量浓度先增加后降低，培养温度为35℃时，GABA质量浓度达到最高值3.17 g/L，菌株最佳发酵温度为35℃。

2.3.2 pH值对酵母产γ-氨基丁酸的影响 发酵条件为：250 mL的摇瓶装液量25 mL，接种体积分数3%，温度30℃，摇床转速200 r/min，调节摇瓶中的起始pH值，分别在pH值4、4.5、5、5.5、6、6.5环境下培养72 h。测定发酵液中γ-氨基丁酸含量，结果见图4。

图4 pH值对GABA产量的影响Fig.4 Effect of pH on GABA

由图4可知，随着pH的升高，GABA质量浓度先升高后降低［11］，说明pH值的高低对于菌株产GABA有一定影响。在pH为5时，GABA质量浓度达到最高值，菌株最适pH值为5.0。

2.3.3 接种量对酵母产γ-氨基丁酸的影响 在温度为30℃，250 mL的摇瓶装液量25 mL，摇床转速200 r/min，pH 7.0条件下，在摇瓶中加入接种量分别为体积分数1%、2%、3%、4%、5%的菌液，培养72 h后，测定发酵液中γ-氨基丁酸质量浓度。由图5可知，随着接种量的增加，GABA质量浓度先增加后降低，接种量达到4%和5%时，GABA质量浓度变化不大，说明接种量超过体积分数4%之后，对于GABA产量影响不大，菌株最适接种量均为体积分数3%。

图5 接种量对GABA产量的影响Fig.5 Influence of medium volume in GABA

2.3.4 培养时间对酵母产γ-氨基丁酸的影响 在温度为30℃、250 mL的摇瓶装液量25 mL、接种量体积分数3%、摇床转速200 r/min、pH 7.0条件下，分别培养12、24、36、48、60、72 h，测定发酵液中γ-氨基丁酸质量浓度。由图6可知，随着发酵时间的延长，发酵液中GABA的产量不断增加，在48 h前产量增加幅度较大，但48 h后继续培养则GABA的产量小幅下降。考虑到发酵时间延长，生产的周期也相应延长，势必增加生产成本，因此实验确定48 h作为生产GABA的最佳发酵周期［12］。

图6 培养时间对GABA产量的影响Fig.6 Influence of Incubation time on GABA

2.4 响应面法优化发酵条件

通过测定GABA含量，确定了GABA产量较高的菌株N8，通过单因素试验确定了试验菌株的最适温度为35℃，最适pH值为5，最适接种量为体积分数3%，最适培养时间为48 h。由此确定四因素三水平试验表，对高产GABA菌株进行四因素三水平响应面试验，确定最适培养条件。

2.4.1 实验设计模型方差分析 设计的因素水平编码见表2。按照试验设计每个组合重复试验3次，GABA产量结果取其平均值，采用Design-Expert 8.0.0软件分析试验结果。由表3回归模型方差分析结果可以看出，实验设计模型P＜0.000 1，极度显著，表明试验设计可靠；失拟项P=0.544 1＞0.05，不显著，表明所建立的二次回归模型成立，试验点均能用模型描述。

表2 GABA产量Box-Behnken设计因素及水平编码Table 2 Coding and the level of GABA content in Box-Behnken design factors

表3 回归模型的方差分析和回归系数的显著性检验Table 3 Analysis of variance for the established regression model and significance test of each regress ion coefficient

根据表3回归模型系数显著性检验结果可知，A、C、D、A2、B2、C2、D2对GABA产量的影响极显著，AB、AD、BD对GABA产量的影响显著，B、AC、BC、CD对GABA产量的影响不显著。GABA产量影响因素依次为D＞C＞A＞B，即接种量＞培养时间＞温度＞pH。

2.4.2 响应面图形分析 由图7温度与pH值的交互作用可以看出，温度为34℃时，随着pH的升高GABA的含量先增加后降低，温度为34℃，pH为5.0时GABA产量达到最高点，此时GABA质量浓度达到4.25 g/L。

图7 温度和pH两因素及其交互作用响应面和等高线Fig.7 Response surface and contour plots showing the effects of three process parameters on the extraction rate of safflower seed meal protein

由图8温度与接种量的交互作用可以看出，温度为34℃时，随着接种量的增加GABA的产量先增加后降低，但是下降幅度不大；温度为34℃，接种量为体积分数3%时GABA产量达到最高点，此时GABA质量浓度达到4.25 g/L。

由图9 pH与接种量的交互作用可以看出，pH为5.0时，随着接种量的增加GABA的产量先增加后降低，接种量从体积分数2%到3%上升幅度较大，pH为5.0，接种量为体积分数3%时GABA产量达到最高点，此时GABA质量浓度达到4.25 g/L。

图8 温度和接种量两因素及其交互作用响应面和等高线Fig.8 Response surface and contour plots showing the effects of three process parameters on the extraction rate of safflower seed meal protein

图9 pH值与接种量两因素及其交互作用响应面和等高线Fig.9 Response surface and contour plots showing the effects of three process parameters on the extraction rate of safflower seed meal protein

2.4.3 模型验证试验 根据模型的响应面图和等高线图可以直观地分析出各自变量之间的关系及显著性，模型分析最佳条件为培养温度 33.95℃，pH值5.01，培养时间 49.17 h，接种量为体积分数3.17%。将N8菌株分别接入经过优化后的最佳条件培养基中，采用比色法测定GABA产量。优化后的GABA产量为 4.926 g/L，试验值与模型计算值相差+2%，模型对实际发酵的情况可以较好地预测，证明响应面分析法对发酵条件的优化是可行有效的。

3 讨论

目前国内外对于乳酸菌产γ-氨基丁酸的研究较多，但对于酵母菌的研究较少，诱变选育研究则更是少。通过初筛、复筛及诱变挑选出高产γ-氨基丁酸的菌株，其中最佳诱变剂量为：最佳诱变时间为30 s，诱变浓度为10-5。经过多次筛选测定菌株γ-氨基丁酸含量，筛选出高产γ-氨基丁酸菌株N8（Hanseniaspora.sp），其γ-氨基丁酸质量浓度高达4.55 g/L，比诱变前产量提高了2.3倍，说明本次试验方法有效。通过单因素和四因素三水平响应面试验优化菌株最适发酵条件，利用Design-Expert软件对Box-Behnken设计的实验结果进行回归拟合，得到理论结果：培养温度 33.95℃，pH值5.01，培养时间 49.17 h，接种量为体积分数3.17%，优化后的γ-氨基丁酸质量浓度也达到了4.926 g/L，与预测值相差不大，表明优化条件符合要求。比胡超［10］等报道的酵母产GABA量2.588 g/L提高很多。

4 结语

酵母菌是重要的微生物资源［11］，在酿造、食品、医药等工业占有重要的地位。各种以酵母为原料或载体的食品和添加剂都得到了很好的推广，其中既有酵母本身的有利条件，也说明了社会对酵母菌这种微生物的认可［12］。随着GABA的生理功能研究不断深入，对GABA的研究开发已经成为新的热点。利用微生物自然资源，分离筛选新功能的酵母菌，生产GABA功能性食品配料，是一种新的尝试，也有利于微生物资源的开发和利用［13］。在现今社会，人们对日常的保健和饮食的要求越来越高，必将导致保健食品消费的热潮，因此高产GABA的酵母菌株的开发应用将有良好的前景［14］。

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科技信息

美国规定2016年6月起婴儿奶粉须含硒

美国食品及药物管理局（FDA）于2015年6月通过一项最终规则，修订关于婴儿配方奶粉营养规格及标签的规例，要求必须把硒加入所需营养清单，并订立婴儿配方奶粉最低及最高的硒含量。该项最终规则的生效日期已确定为2016年6月22日。《美国食品、药品及化妆品法》规定婴儿配方奶粉必须含有29种指定营养，并为各种营养订立最低含量水平，也为其中9种营养订立最高含量水平。FDA最初为婴儿配方奶粉订立营养规格时，未有把硒列为必要营养。其后，硒被认定为一种必要营养，遂于今年6月决定把硒列入所需营养清单，并规定婴儿配方奶粉须标明每100千卡的硒含量。同时要求婴儿配方奶粉的最低及最高硒含量分别为2.0微克/100千卡和7.0微克/100千卡。

［信息来源］国家质量监督检验检疫总局.美国规定2016年6月起婴儿奶粉须含硒 ［EB/OL］.（2016-6-22）.http:// www.aqsiq.gov.cn/xxgk_13386/tzdt/gzdt/201606/t20160622_468802.htm

Screening，Identification and Optimizing of γ-Aminobutyric Acid Production in Yeast

XIAO Jing1，XU Yanan2，LI Qi2，ZHANG Yanwei2，LIU Yan2，SHI Xuewei*2

（1.College of Information Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832000，China；2.College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

A strain with capability of producing γ-aminobutyric acid was isolated from the traditional food in Xinjiang and the fermentation conditions were optimized.Non-Saccharomyce yeast were isolated and further used to screen the strain with high yield of γ-aminobutyric acid.The isolated strain was identified as Hanseniaspora uvarum XYN019 by morphology and phylogenetic analysis based on the 26S rRNA sequence.The activity of amino acid production was 2.3 times higher as compared with the original one by UV mutagenesis.The optimum mutagenesis conditions are with 30s irradiation and 10-5concentration.The better transformation conditions as follows：initial pH 5.01，culture temperature 33.95℃，inoculum size 3.17%and culture time 49.17 h.In this condition，the yielding capacity of GABA by the mutant was 4.926 g/L.These results suggested that the strain can be used to produceγ-aminobutyric acid and has a higher converting capability of GABA.

γ-aminobutyric acid，screening，identification，non-Saccharomyce

TQ 925.6

A

1673—1689（2016）08—1093—07

2015-03-03

新疆生产建设兵团科技攻关项目（P20136500002-1146，2015AB016，2016AB009）；新疆生产建设兵团青年科技创新资金项目（DEC_PGUEIK_893341）；新疆生产建设兵团科技攻关与成果转化计划项目（2016AD024）。

肖 婧（1982—），女，甘肃会宁人，工学硕士，讲师，主要从事生物信息学研究。E-mail：463091503@qq.com

*通信作者：史学伟（1980—），男，甘肃会宁人，工学博士，副教授，主要从事酵母菌种遗传研究。E-mail：1549730027@qq.com