丹槐银屑浓缩丸治疗家兔寻常型银屑病的机制研究

冯 萍，黄 萍，吴胜英



丹槐银屑浓缩丸治疗家兔寻常型银屑病的机制研究

冯 萍1，黄 萍1，吴胜英2*

目的 建立兔寻常型银屑病动物模型，探讨丹槐银屑浓缩丸对其血管内皮生长因子及受体表达的影响。方法 将40只家兔随机分为对照组、模型组、阿维A组、丹槐组。测定4组家兔耳病变组织VEGF蛋白及VEGF mRNA的表达，以及受体1(FLT-1)、受体2(KDR)的表达量，检测真皮乳头血管密度(MVD)、外周血T淋巴细胞百分率及肝功能三项[胆汁酸(TBA)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)]。结果 治疗后，与模型组比较，丹槐组VEGF蛋白及VEGF mRNA、受体FLT-1、受体KDR表达、MVD、T淋巴细胞百分率均显著下降(P<0.05)；与阿维A组比较，丹槐组VEGF蛋白及VEGF mRNA、受体FLT-1、受体KDR表达明显下降。丹槐组与阿维A组间MVD、T淋巴细胞百分率比较差异无统计学意义(P>0.05)。丹槐组肝功能指标均在正常范围内。结论 丹槐银屑浓缩丸在不影响动物肝功能的情况下，可降低实验性寻常型银屑病家兔耳病变组织VEGF的过度表达，阻断VEGF与其受体结合，抑制病变组织皮下血管新生与重建，并具有与阳性阿维A类似的抑制T细胞增殖的作用，可抑制T细胞介导的皮损局部炎症反应，进而降低真皮乳头微血管的异常增生，减轻寻常型银屑病对皮肤组织的破坏。

丹槐银屑浓缩丸；寻常型银屑病；血管内皮生长因子；真皮乳头血管密度；肝功能

0 引言

寻常型银屑病又称“白疙”，系外邪化热入血，血瘀、血燥、血热病症并存乃现风热湿之象而发病[1]。中医在治疗寻常型银屑病时，讲究“治风先治血，血行风自灭”。丹槐银屑浓缩丸由槐花、丹参、黄连、鸡血藤、柴草、地黄、赤芍、白鲜皮、大青叶等诸药配伍调合而成，其主要有效药理成分为丹参酮、黄连素、小檗碱、丹参素等，具有祛屑止痒、清热解毒、凉血活血的功效[2]，在临床治疗中取得了肯定的疗效。银屑病患者病变脱落的皮屑中有VEGF (Vascular endothelial growth factor，VEGF)高表达及T淋巴细胞异常增殖的现象，动物实验也有类似发现[3]，故抑制VEGF过度表达及T淋巴细胞异常增殖可减轻病变组织微小静脉血管的通透性，降低血管内皮细胞分裂增殖；抑制VEGF与其受体FLT-1、受体KDR结合，可降低VEGF诱导血管再生而起治疗作用。本研究系统观察丹槐银屑浓缩丸在治疗寻常型银屑病皮损中的作用，探讨其作用机制，为临床治疗寻常型银屑病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 家兔40只，体重(2.0±0.2) kg，采用随机数字表编号随机分为对照组、阿维A组、模型组、丹槐组，每组10只。治疗过程中保证动物房温度为22～26 ℃，湿度45%～75%，自然光照，动物应分笼饲养以免干扰治疗，给予家兔自由饮水、普通饲料喂养，及时清理粪便，每日观察动物进食情况。本研究中动物处置方法符合动物伦理学标准。治疗过程中观察动物皮损部位病理改变，治疗结束后取病变组织做病理学检查，观察表皮角质层是否角化，以及钉突及棘层的病理改变情况。

1.2 仪器及药品 丹槐银屑浓缩丸(黑龙江省中医研究院医院研制，规格：1 g/丸，批号：090801)；普萘洛尔片(江苏常州亚邦制药有限公司，批号：040512)；阿维A胶囊(重庆华邦制药有限公司，10 mg，批号：20010126)；兔VEGF共调节趋化因子1 (VCC1) ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批号：028457)；提取mRNA试剂及反转录试剂(美国Invitrogen公司)。

1.3 家兔寻常型银屑病动物模型的制备及给药方法 参照文献[4]，先将普萘洛尔片研碎加蒸馏水配制成5%溶液造模，阿维A胶囊研碎加蒸馏水配制成5%的溶液，丹槐银屑浓缩丸配制成10%的溶液备用。造模型时，剃去4组家兔双耳背侧兔毛，阿维A组、模型组、丹槐组家兔用5%普萘洛尔均匀涂成直径约1 cm、厚1 mm的药物层，以双耳涂药处出现寻常型银屑病样皮损为造模成功，对照组涂生理盐水。四组家兔均1次/d给药，连续涂1个月造模。本研究中，阿维A组、模型组、丹槐组造模1个月均出现典型的寻常型银屑病样皮损，造模成功率为100%。参照文献[5]，根据人与动物体表面积换算公式[家兔用药剂量(mg/kg)=w(人与兔体表面积换算系数)×A(人用药剂量)]，家兔阿维A胶囊用药量为5 mg/kg [10 mL/(kg·d)]，丹槐银屑浓缩丸用药量为10 mg/kg [10 mL/(kg·d)。造模成功后，阿维A组用5%阿维A溶液10 mL/(kg·d)灌胃；丹槐组用10%丹槐银屑浓缩丸溶液[按10 mL/(kg·d)灌胃]；空白模型组和模型组给予等体积生理盐水。四组动物均连续治疗1个月。

1.4 检测指标 参照文献[6]，取家兔寻常型银屑病样皮损部位组织，石蜡包埋、切片，按常规处理，微波抗原修复后，用兔抗人CD34单抗(DAKO公司)显色、苏木素复染，在高倍镜(×400)下观察被CD34抗体染成棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇，不论管腔内有无红细胞，均作为一个微血管计数，计算5个高倍镜(×400)视野下微血管数平均值为MVD。参照文献[7]，分别经家兔耳缘静脉取外周血，计算治疗前后T淋巴细胞百分率。取家兔寻常型银屑病样皮损部位组织编号，采用ELISA法测定各组兔寻常型银屑病样皮损部位组织VEGF蛋白、FLT-1、KDR蛋白表达的光密度OD值。用SP-Max 3500FL型多功能荧光酶标仪于450 nm波长下测定VEGF蛋白的OD值，提取总RNA，设计20 μL体系，以AMV 逆转录酶进行逆转录反应。以逆转录反应中获得的cDNA模板1 μL、GAPDH 为内对照，设计20 μL PCR 扩增体系。上游引物：5′-GTTTCTGCTGCCTTGTAT-3′。下游引物：5′-ACTATGTCGCTTTCTTGG-3′。94 ℃预变性5 min 后，按94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，扩增30个循环，最后在72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下拍照，根据各条带的吸收度，采用GEL-Pro Analyzer软件分析VEGF的mRNA表达水平。

2 结果

2.1 家兔肝功能ALT、AST、TBA比较 见表1。治疗前后对照组、模型组的肝功能三项指标(ALT、AST、TBA)均保持在正常水平。治疗后1个月，阿维A组的ALT、AST、TBA升高，与对照组、丹槐组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 家兔皮损组织VEGF蛋白、VEGF mRNA表达及外周血T淋巴细胞百分率比较 见表2。治疗前后，对照组皮损组织VEGF蛋白、VEGF mRNA表达及T淋巴细胞增殖百分率维持在较恒定水平(P>0.05)；模型组上述指标均高于对照组(P<0.05)，说明造模型成功。治疗后，阿维A组VEGF蛋白、VEGF mRNA表达略有降低，但与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；T淋巴细胞显著降低，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后，丹槐组VEGF蛋白、VEGF mRNA表达均明显降低，与模型组及阿维A组比较差异有统计学意义(P<0.05)；T淋巴细胞百分率降低，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 家兔皮损组织 MVD、KDR及FLT-l比较 见表3。对照组治疗前后MVD、KDR 及FLT-l均较低。模型组MVD、KDR及FLT-l与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后，阿维A组MVD显著降低，与对照组及模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；KDR、FLT-l略有降低，但与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后，丹槐组FLT-l、KDR均降低，与模型组及阿维A组比较差异有统计学意义(P<0.05)；MVD显著降低，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

寻常型银屑病具有易复发性、顽固性、泛发性的特点，发病多与遗传、自身免疫异常有关，T淋巴细胞增殖、内分泌失调、炎症因子、精神神经等因素均可诱发或加重病情[8]。大量研究表明，银屑病患者VEGF及其受体FLT-1、KDR出现异常表达，且与寻常型银屑病病理改变呈正相关[9]，VEGF过度表达刺激介导可造成真皮血管(尤其是真皮乳头微血管)的重构与新生，病理检查显示，MVD密度增高、毛细血管扩张、表皮细胞增殖过快和角化不全而加重病理进程[10-11]。

表1 家兔肝功能ALT、AST、TBA比较

注：*与阿维A组比较，P<0.05；#与模型组比较，P<0.05

表2 家兔皮损组织VEGF蛋白、VEGF mRNA表达及T淋巴细胞增殖百分率比较(n=10)

注：*与阿维A组比较，P<0.05；#与模型组比较，P<0.05

表3 丹槐银屑浓缩丸对家兔皮损组织FLT-l、KDR及MVD的影响

注：*与阿维A组比较，P<0.05；#与模型组比较，P<0.05

本研究结果显示，模型组家兔VEGF蛋白、VEGF mRNA、FLT-l、KDR、MVD及T淋巴细胞均明显高于对照组，说明VEGF过度表达及T淋巴细胞异常增殖与寻常型银屑病有明确的相关性。治疗后，阿维A组VEGF蛋白、VEGF mRNA、FLT-l、KDR未明显降低，说明阿维A治疗寻常型银屑病的药理作用与VEGF表达无关；同时，由于阿维A的药理作用主要是抑制T细胞及角质形成细胞增殖，抑制表皮Ⅰ型转谷氨酰胺酶，促进角质形成细胞分化，且抑制白细胞趋化性[12]，使得T淋巴细胞显著降低。但阿维A会造成严重的肝功能损害。治疗后，丹槐组VEGF蛋白、VEGF mRNA及其受体FLT-l、KDR表达及MVD明显降低，且没有出现明显的肝功能损害。结果表明，丹槐银屑浓缩丸可明显下调异常升高的VEGF及其受体FLT-l、KDR表达。

VEGF蛋白是一种高度特异性、功能最强的促血管形成因子[13]，具有促进血管活性物质合成、血管内皮细胞增殖迁移及再生的特殊功能[14]。正常情况下，机体VEGF蛋白及其受体KDR、FLT-l维持一定的平衡关系，以保证血管内皮及功能正常。当机体抵抗力下降或炎症刺激、免疫异常，尤其是出现应激反应时，VEGF蛋白及其受体FLT-l、KDR间的平衡可能被破坏，VEGF、FLT-l、KDR均可出现过度表达，进而刺激真皮乳头微血管的异常增生，加重寻常型银屑病的发生发展，导致严重银屑病皮损。

本方中，紫草为君药，味苦性寒，可凉血清热；黄连、大青叶、白鲜皮为臣药，可清热解毒[15]，其中，黄连的有效成分-小檗碱和黄连素具有清热解毒、抗炎清肿的作用[16]。方中丹参、鸡血藤等佐药均为活血化瘀的良药，中药典籍《吴普本草》谓“丹参味辛、性凉”，其主要有效药理成分-丹参酮及丹参素均具有活血化淤的作用，可拮抗心、脑血管平滑肌细胞Ca2+内流，改善机体ATP酶的活性，松弛心、脑血管平滑肌而达到改善微循环的作用[17]。另外，白茅根药性寒，可凉血生津、清热利水，泽泻药性甘寒、可泄热毒。以上君臣诸药可清泄热毒、凉血活血、疏通肤络、祛屑止痒，抑制VEGF蛋白及其受体FLT-l和KDR的过度表达。由于寻常型银屑病的T淋巴细胞异常增殖，故其T淋巴细胞介导的异常增殖也可能是寻常型银屑病的发病机制之一[18]，T细胞皮肤归巢与寻常型银屑病皮损密切相关[19]。本研究显示，丹槐组的T淋巴细胞百分率明显降低，但作用没有阿维A明显，结果表明，丹槐银屑浓缩丸可抑制T淋巴细胞增殖，作用与阳性治疗药物阿维A类似。

总之，丹槐银屑浓缩丸有明确的凉血活血、清热解毒、祛风止痒的功效[20]，在不影响动物肝功能的情况下，可阻断VEGF与其受体结合，降低寻常型银屑病模型动物病变组织血管内皮VEGF的过度表达和T细胞增殖介导的炎症反应，通过减少真皮乳头微血管的异常增生、降低皮损而达到治疗作用。

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Study on the mechanism of Danhuaiyinxie concentrated pill in the treatments of psoriasis vulgaris of rabbits

FENG Ping1,HUANG Ping1,WU Sheng-ying2*(1.Department of Dermatology,Shiyan Taihe Hospital,Shiyan 442000,China;2.Department of Pathophysiology,Hubei Medical College,Shiyan 442000,China)

Objective To establish the animal model of psoriasis vulgaris,and to study the effect of Danhuaiyinxie concentrated pill on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor.Methods Forty rabbits were randomly divided into control group,model group,acitretin group and danhuai group.The VEGF protein and expression of VEGF mRNA,and the receptor 1 (Flt-1) and receptor 2 (KDR) expression were detected in ear tissue of rabbits.Then the dermal papillary vascular density (MVD),percentages of peripheral blood T lymphocyte and three indexes of liver function (TBA,ALT and AST) were recorded.Results After treatment,MVD,percentages of peripheral blood T lymphocyte and the expression of VEGF protein,VEGF mRNA,FLT-1 and KDR in danhuai group were lower than those of model group (P<0.05);the expression of VEGF protein,VEGF mRNA,FLT-1 and KDR in danhuai group was lower than that of acitretin group,but no significant difference was found in MVD and the percentages of peripheral blood T lymphocyte between danhuai group and acitretin group (P>0.05).The indexes of liver function (TBA,ALT and AST) were normal in danhuai group.Conclusion Danhuaiyinxie concentrated pill can reduce the over-expression of VEGF in the ear tissue of experimental rabbit model of psoriasis vulgaris,block the binding of VEGF to its receptors,and inhibit the angiogenesis and reconstruction of the lesion tissue and T cell proliferation with similar effect as acitretin,thus reducing the abnormal proliferation of dermal microvessels and the damage of psoriasis vulgaris to skin tissue.

Danhuaiyinxie concentrated pill;Psoriasis vulgaris;Vascular endothelial growth factor (VEGF);Density of blood vessels in papillary dermis;Liver function

2016-03-01

1.十堰市太和医院皮肤科(湖北医药学院附属医院)，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院病理生理教研室，湖北 十堰 442000

湖北省教育厅重点项目(D20092404)

10.14053/j.cnki.ppcr.201610003

*通信作者