牛乳中大肠杆菌O157∶H7 PCR检测方法的建立

刘　鑫，姚　笛，郭　瑜，张　微，佐兆杭，侯婷婷

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆　163319）

牛乳中大肠杆菌O157∶H7 PCR检测方法的建立

刘鑫，姚笛，郭瑜，张微，佐兆杭，侯婷婷

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319）

为了建立牛乳中大肠杆菌O157∶H7的PCR快速检测方法，试验对大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因序列进行分析，设计1对特异性引物，对大肠杆菌O157∶H7的DNA进行PCR扩增，结合特异性和灵敏性试验，实现对致病性大肠杆菌O157∶H7的检测；然后将不同含量的大肠杆菌掺入到牛乳中进行实际样品的检测。结果表明，该方法的特异性和灵敏性较好，能够检测到0.1 ng/μL的DNA模板，当牛乳中含有超过100 CFU/mL的大肠杆菌时，可利用该方法进行检测。

大肠杆菌O157∶H7；PCR技术；检测

大肠杆菌O157∶H7是一种肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC） 的代表菌株，它是能够引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌［1］。大肠杆菌O157∶H7可产生大量毒素，从而引起出血性结肠炎等疾病［2］。自美国首次分离出该菌以后，O157∶H7的爆发和流行相继出现在全球五大洲的20多个国家［3］。目前，我国还未对由大肠杆菌O157∶H7引起的食物中毒进行比较系统的调查、分析和统计，但是从我国的饮食结构、食品加工、贮藏和运输条件等方面推测大肠杆菌O157∶H7的污染情况是比较严重的［4］。另外，大肠杆菌O157∶H7主要附着在人或动物的肠道内，可通过粪便等多种途径污染食品，为了保障食品的食用安全性，有必要对食品中的大肠杆菌O157∶H7进行快速检测。

目前，大肠杆菌O157∶H7的检测方法主要是常规的细菌学分离鉴定方法，该方法存在耗时长、过程复杂、灵敏性不强等缺点。酶联免疫法（ELSIA）等免疫学方法需要进行单克隆抗体的制备，建立该方法耗时、费力，且存在非特异性吸附等缺点［5］。PCR检测方法具有快速、准确的特点，可实现对致病菌的定性检测［6］。因此，本研究以大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因为靶序列，拟建立一种牛乳中大肠杆菌O157∶H7的PCR检测方法，该技术与常规检测相比具有更强的特异性和灵敏性。建立的方法能够使牛乳中大肠杆菌O157∶H7的检测更为快速和准确，并为其他致病菌的快速检测提供参考。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株

大肠杆菌O157∶H7、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌菌种，均由黑龙江八一农垦大学食品生物技术实验室保存。

1.1.2试剂

LB培养基，青岛海博公司产品；rTaq（5 U/μL）、TaKaRa ExTaqTM（5 U/μL）、MgCl2（25 mmol/L）、DL2000 DNAMarker、dNTPs（10 mmol/L）、6×Loading Buffer等，TaKaRa公司产品。

1.1.3培养基

LB液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 L，在121℃下灭菌20 min。

LB固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂粉15～20 g，蒸馏水1 L，在121℃下灭菌20 min。

1.1.4仪器设备

TGL-16B型台式离心机，上海安亭科学仪器制造厂产品；9700型PCR基因扩增仪，基因有限公司产品；JY04S-3B型电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司产品；YJ600+型凝胶成像系统，北京君意东方电泳有限公司产品。

1.2试验方法

1.2.1细菌的培养

将大肠杆菌O157∶H7接种于LB固体培养基中，37℃培养24 h，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃转速200 r/min，培养12 h。

1.2.2DNA模板的制备

取上述细菌培养液，以1%接种于5 mL LB液体培养基中，37℃转速200 r/min，培养过夜，取细菌培养液1.0 mL，置于EP管中，以转速12 000 r/min离心2 min，然后用ddH2O洗涤2次，最后加入300 μL ddH2O，隔水煮沸15 min，以转速8 000 r/min离心15 min，取上清液，即为DNA模板。置于-20℃下保存备用。

对于PCR特异性检测所用的蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌的DNA模板制备均按照上述方法进行，DNA模板置于-20℃下保存。

1.2.3引物的合成

根据Genebank发表的大肠杆菌O157∶H7 rfbE基因序列，利用Primer 5软件设计特异性引物。上游引物：5'-CATCTTTACTTTCCTTGTGGACTT G-3'；下游引物：5'-AAACTATTACTACAGGTGAAGGTGG-3'。扩增片段大小为261 bp，引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.2.4PCR扩增

以提取的基因组DNA为模版，使用设计的引物扩增rfbE基因片段，反应体系为 10×PCR buffer 2 μL，dNTP Mixture 1.5 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq酶0.2 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反应条件为95℃预变性3 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环，最后72℃延伸7 min；获得的PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.5特异性检测

以提取的大肠杆菌O157∶H7、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌的DNA为模板，利用大肠杆菌rfbE基因的特异性引物进行PCR检测，然后进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.6灵敏性检测

测定大肠杆菌O157∶H7的DNA质量浓度，用ddH2O对已知质量浓度的DNA进行10倍梯度稀释，分别取100，10，1，0.1，0.01，0.001 ng/μL的DNA样品1 μL进行PCR扩增，检测该方法的灵敏性。

1.2.7PCR用于实际样品的检测

将大肠杆菌培养液用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，进行菌数的测定，然后用生理盐水进行菌体的洗涤，分别将含有1.0×105，1.0×104，1.0×103，1.0×102CFU/mL的大肠杆菌接入10 mL灭菌牛乳中，使牛乳中分别含有1.0×104，1.0×103，1.0×102，10 CFU/mL的大肠杆菌，然后提取牛乳样品的DNA，以其为模板进行PCR扩增。

2　结果与分析

2.1大肠杆菌O157∶H7的PCR扩增结果

蜡样芽孢杆菌PCR扩增结果见图1。

由图1可知，扩增片段的大小在250 bp左右，与预期结果相符。

2.2大肠杆菌O157∶H7的特异性检测结果

以大肠杆菌O157∶H7、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌的DNA为模板，利用大肠杆菌rfbE基因的特异性引物进行PCR扩增。

特异性检测结果见图2。

由图2可知，只有大肠杆菌O157∶H7出现目的片段的扩增，而其他能够引起食物中毒的致病菌未见扩增，说明该方法的特异性良好。

2.3大肠杆菌O157∶H7的灵敏性检测结果

灵敏性检测结果见图3。

由图3可知，当DNA质量浓度为0.1 ng/μL以上时可见特异性扩增，而DNA质量浓度为0.01 ng/μL时未见特异性扩增，说明该方法的灵敏度较高，可达到0.1 ng/μL。

图1　蜡样芽孢杆菌PCR扩增结果

图2　特异性检测结果

图3　灵敏性检测结果

2.4掺乳样品的检测结果

对大肠杆菌O157∶H7培养液进行菌落计数，测得的菌落总数为9.0×108CFU/mL。对菌体洗涤稀释后，分别提取不同掺乳样品的DNA，以其为模板进行PCR扩增。

掺乳样品的PCR扩增结果见图4。

由图4可知，当牛乳中分别含有1.0×104，1.0× 103，1.0×102CFU/mL的大肠杆菌时可见特异性扩增，目的条带为100～250bp。而牛乳中含有10 CFU/mL的大肠杆菌时未见特异性扩增，说明牛乳中含有超过100 CFU/mL的大肠杆菌时，可利用该PCR方法进行检测。

图4 掺乳样品的PCR扩增结果

3　结论

对大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因进行PCR扩增，结合特异性和灵敏性试验，实现对致病性大肠

杆菌O157∶H7的检测；然后将不同CFU含量的大肠杆菌掺入到牛乳中进行实际样品的检测。结果表明，该方法的特异性和灵敏性较好，能够检测到0.1 ng/μL的DNA模板，当牛乳中含有超过100 CFU/mL的大肠杆菌时可利用该方法进行检测。因此，该PCR检测方法可以应用到实际样品中大肠杆菌的检测，检测时间3～4 h，检测速度快、灵敏度高。

［1］王培育.肠出血性大肠杆菌O157∶H7检测技术进展 ［J］.国际检验医学杂志，2013，34（19）：23-28.

［2］Li Y，Frey E，Mackenzie A M，et al.Human response to Escherichia coli O157:H7 infection：antibodies to secreted virulence factors［J］.Infect Immun，2013，68（9）：211-219.

［3］徐兆炜．英国（苏格兰） O157大肠杆菌干扰爆发流行 ［J］．预防医学情报杂志，1997，13（1）：65-69.

［4］林鹭芳，黄健利，钟凌.漳州市首次检出E.coli O157∶H7［J］．海峡预防医学杂志，2002（4）：43-47.

［5］陈玲霞，丁洪强.食品中大肠杆菌检测方法研究进展 ［J］．疾病监测与控制杂志，2010，4（6）：325-326.

［6］宋宏新，李明亮.PCR检测乳品中大肠杆菌的研究 ［J］.食品科学，2009，30（4）：260-263.◇

Establishment of PCR Method for Detection of Escherichia coli O157∶H7 in Milk

LIU Xin，YAO Di，GUO Yu，ZHANG Wei，ZUO Zhaohang，HOU Tingting
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

In order to establish PCR rapid detection method on Escherichia coli（E.coli）O157∶H7 of milk.The rfbE gene sequence of E.coli O157∶H7 is analyzed in the experiment and a pair of specific primers are designed.E.coli DNA is amplified by PCR，combined with the specificity and sensitivity experiments，the detection of pathogenic E.coli O157∶H7 is implemented.Then different content of E.coli are added to milk to detect the actual samples.The results show that this method had good specificity and sensitivity，can detected 0.1 ng/μL DNA template，when milk contains more than 100 CFU/mL E.coli，this method can be used for testing.

Escherichia coli O157：H7；PCR technology；detection

TS252.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.043

2015-11-12

刘鑫（1993— ），男，本科，研究方向为微生物检测。