miR-152在非小细胞肺癌患者血清中的表达及临床意义

强 勇，杨 楠，张 雷，李 鹏，刘 凯，吴海卫，申 翼，李忠东

(南京军区南京总医院心胸外科 210002)



论著·临床研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.023

miR-152在非小细胞肺癌患者血清中的表达及临床意义

强 勇，杨 楠，张 雷，李 鹏，刘 凯，吴海卫，申 翼，李忠东△

(南京军区南京总医院心胸外科 210002)

[摘要] 目的 通过检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清中microRNA-152(miR-152)的水平，探讨其与NSCLC的关系。方法 采用Real time-PCR法检测61例NSCLC患者和80例健康对照者血清miR-152的表达水平，并分析其与临床病理指标间的关系。结果 NSCLC组血清miR-152 的表达水平显著降低(P<0.01)。且其表达量与患者吸烟史和TNM分期有关，有吸烟史的NSCLC晚期的患者表达更低(P<0.05)，而在不同年龄、性别、组织学类型、肿瘤分化间差异无统计学意义(P>0.05)。根据miR-152的表达水平绘制ROC曲线，曲线下面积为0.820(95%CI=0.752～0.889)，临界值取0.48时，灵敏度和特异度分别为63.80%和90.20%。结论 NSCLC患者血清中miR-152表达低，且与肿瘤分化程度相关，miR-152可能作为NSCLC诊断的特异肿瘤标志物。

miR-152；癌，非小细胞癌；逆转录聚合酶链反应；ROC曲线

[Abstract] Objective Tto investigate the expression of microRNA-152(miR-152)in the serum of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)，and to explore the clinical significance of NSCLC.Methods The relative expression levels of miR-152 in serum of 61 NSCLC patients and 80 healthy individuals were assessed by quantitative real-time PCR(RT-PCR),and the clinical pathological parameters was analyzed.Results The expression of miR-152 was significantly lower in the serum of NSCLC than that of controls(P<0.01).Down regulation of miR-152 was found to be correted with the clinicopathological features such as smoking histroy and TNM staging(P<0.05),but there was no significant difference in different age,sex,histological type and tumor differentiation(P>0.05).The ROC curve for miR-152 revealed a strong diagnostic performance,the value of the area under ROC(AUC-ROC)was 0.820(95%CI：0.752-0.889),optimal sensitivity and specificity were 63.80% and 90.20% when 0.48 was selected as the critical value.Conclusion It was found that miR-152 is significantly reduced in serum samples of NSCLC patients,and the data suggests that it may be a particular biomarker for the clinical diagnosis of NSCLC.

肺癌，尤其是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是人类罹患癌症死亡的主要原因，每年全球有超过500 000人死亡[1]。尽管近年来在NSCLC的早期发现和治疗上有所进步，但其高病死率并未显著下降。NSCLC往往在确诊时已属晚期，且5年生存率低于15%[2]。NSCLC的不良预后主要是由于缺乏规范有效而又经济实用的诊断方式，以便能够筛选出早期的肿瘤。有文献报道及时诊断治疗早期NSCLC可将患者5年生存率提高到60%～80%[1,3]，所以开发这样的生物标志物是一个关乎公共健康，势在必行的举措。微小RNA(miRNAs)是一类含量丰富的，包含17～25个核苷酸的小的非编码RNA，它通过直接结合到靶mRNA的3′端非翻译区(3′UTR区),从而在转录后水平调控基因表达[4-5]。miRNAs是一类重要的调节因子，参与到很多生理病理过程，例如细胞生长、分化、凋亡及肿瘤的发生、转移、恶化[6-7]。鉴于它的多功能性，miRNAs的表达水平或许能够作为肿瘤的标志物。miR-152属于miR-148/152家族[8]，已经确定它在标本和细胞系下调[9-10]。然而，miR-152在NSCLC患者血清中的表达报道还不多。因此,在本研究中，笔者通过检测61例NSCLC患者和 80例健康个体血清miR-152的表达水平，来分析其表达与患者临床资料间的联系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 血样来自2014年3月至2015年4月在本院接受原发性NSCLC手术切除的患者61例(NSCLC组)，原发性NSCLC均为初次发现，均经病理组织学确诊，术前未行任何抗肿瘤治疗。患者中男40例，女21例，中位年龄60岁(32～77岁)。病理类型包括鳞癌26例，腺癌30例，腺鳞癌5例。TNM分期按照国际肺癌研究会(IASLC)公布的标准，Ⅰ/Ⅱ期37例，Ⅲ/Ⅳ期24例。本研究经本院医学伦理学委员会批准，患者签署知情同意书。此外，选取本院同期80例体检中心健康个体为对照组，男50例，女30例，年龄28～72岁，中位年龄58岁。经检查均无肝、肺、肾、脑等脏器疾病，无消化道和血液系统疾病史。研究对象均于清晨空腹采血3～5 mL于促凝管中，3 000 r/min离心10 min分离血清，吸取上清液并迅速置于-80 ℃保存。

1.2 主要试剂及仪器 基因扩增检测仪LightCycler480RⅡ购自德国Roche公司；miRcute miRNA提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒和miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒购自Tiangen公司；引物均由上海英骏生物技术有限公司合成并修饰。

1.3 总RNA提取 按miRcute miRNA提取试剂盒说明书抽提血清，用核酸蛋白检测仪在OD260/280 nm处测定OD值，计算miRNA的含量及纯度。利用miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒反转录成20 μL cDNA，cDNA样本置-20 ℃保存备用。

1.4 实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)检测 扩增所用的miR-152和U6的引物序列见表1。PCR总反应体系为20.0 μL，内含2×miRcute miRNA Premix 10.0 μL，10 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2.0 μL，其余加双蒸水补足。扩增条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s(温度转换率均为20 ℃/s)，扩增40个循环。60 ℃延伸时采集荧光信号，所有样品均做复孔，miR-152的相对表达量用2-ΔΔCt法表示。

表1 miRNAs的引物序列

2 结 果

2.1 miR-152的表达水平 miR-152的相对表达量通过同一样本miR-152与U6的比值来表示。NSCLC患者血清miR-152 的表达量为0.23±0.19，显著低于对照组的1.54±0.67，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

2.2 肺癌患者临床参数与miR-152表达的关系 分析NSCLC患者中miR-152表达水平与患者年龄、性别、吸烟史、组织学类型、肿瘤分化及TNM分期等临床病理参数的关系。结果显示，miR-152在有吸烟史的患者中表达量低于无吸烟史的患者(P<0.05)；且晚期患者miR-152表达水平显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 miR-152对NSCLC的诊断价值 对61例NSCLC患者血清miR-152水平建立ROC曲线，见图2，利用ROC曲线评价miR-152的诊断价值。AUC为0.820(95%CI：0.752～0.889)。当临界值取0.48时，灵敏度和特异度分别为63.80%和90.20%。

>a：P<0.05。

图1 NSCLC组和对照组血清的miR-152表达水平

图2 miR-152 ROC曲线

项目占比n(%)miR⁃152相对表达量P性别>0．05 男40(65．6)0．25±0．09 女21(34．4)0．20±0．08年龄>0．05 <60岁27(44．3)0．17±0．07 ≥60岁34(55．7)0．25±0．09吸烟史<0．05 不吸烟30(49．2)0．29±0．11 吸烟31(50．8)0．12±0．06组织学类型>0．05 鳞癌26(42．6)0．27±0．10 腺癌30(49．2)0．17±0．08 腺鳞癌5(8．2)0．14±0．04肿瘤分化>0．05 中分化19(31．2)0．17±0．09 中低分化18(29．5)0．20±0．11

续表2 NSCLC患者临床参数及其与血清中miR-152水平的关系

3 讨 论

miRNAs非常稳定，即使是在成分复杂的富含RNase酶的血清中，也可以长时间存在[11]。在某些疾病包括NSCLC中，它们的表达水平会发生变化[12]，由此他们可被选作生物标志物，用来检测疾病的发生和进展。目前，一些在疾病发病过程中有明显改变的miRNAs，已作为新型的血液标志物应用到这些疾病的诊断和预后上。NSCLC病死率居全球癌症前两位，迄今为止仍然无非常可靠的生物指标来诊断早期的NSCLC。

本研究中，作者通过定量RT-PCR检测血清中miR-152的表达，发现miR-152在NSCLC患者中显著下调(P<0.001)。进一步分析发现miR-152与临床病理特征，如患者的吸烟史、TNM分期相关(P<0.05)。ROC曲线显示血清miR-152能作为诊断NSCLC的可靠生物标志物，其AUC为0.820(95%CI：0.752～0.889)，灵敏度和特异度分别达到63.80%和90.20%。本试验证实miR-152的表达水平在NSCLC患者和健康个体中显著不同，依据其表达差异，miR-152可用于筛选患NSCLC的个体。这一研究表明，血清中的miR-152可作为区分NSCLC的一种新型的非侵入性生物标志物。

已有文献报道了miR-152在很多肿瘤中表达下调，例如miR-152在HBV相关的肝癌组织中表达下调[13]；Chen等[14]报道了胃肠道肿瘤组织及细胞株中miR-152表达显著降低，并且降低的程度与肿瘤组织大小及肿瘤分期密切相关；而在肺癌方面，Cheng等[9]通过检测30例NSCLC患者的肿瘤组织和正常组织发现miR-152在肺癌组织中表达下降，并与其预后不良相关；Su等[10]证实这一结果，并且发现上调miR-152表达能明显抑制NSCLC细胞的增殖、克隆形成及迁移和侵袭。进一步分析表明了miR-152通过下调靶基因FGF2和ADAM17的表达[9-10]，从而抑制NSCLC的增殖和侵袭。虽然对NSCLC肿瘤中miR-152的研究较多，但对NSCLC患者外周血中miR-152研究较少，作者的研究填补了这一空缺，也证实miR-152在NSCLC患者血清中的表达与之前组织中的报道一致，均显著减少。但是因为本研究所选用的样本数较少，所以研究结果还带有一定的局限性。

综上所述，本研究发现miR-152在NSCLC患者的血清中表达显著减少。检测外周血中miR-152的可作为一种无创性、快速的诊断工具，用于筛选患NSCLC的个体。下一步笔者将收集更多患呼吸道疾病的血清样本，进一步确定miR-152的表达是否可作为一个潜在的预测NSCLC的生物标志物。

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Serum microRNA-152 expression and its clinical significance in patients with non-small cell lung cancer

QiangYong，YangNan，ZhangLei，LiPeng，LiuKai，WuHaiwei，ShenYi，LiZhongdong△

(DepartmentofCardiothoracicSurgery，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand，Nanjing，Jiangsu210002，China)

microRNA-152；carcinoma,non-small cell lung；R7-PCR；Roc curve

强勇(1978-)，主治医师,硕士,主要从事肺癌基础与临床研究。△

R735.1

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1671-8348(2016)28-3956-03

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