MIS后病灶区灌注RSG对家兔ICH模型血肿周围继发性脑损伤的作用

任思颖，杨 勤,伍国锋△，张 艳，李 军

(1.贵州医科大学附属医院急诊医学科，贵阳 550004；2.贵州医科大学病理生理学教研室，贵阳 550000)



MIS后病灶区灌注RSG对家兔ICH模型血肿周围继发性脑损伤的作用

任思颖1，杨 勤2,伍国锋1△，张 艳1，李 军1

(1.贵州医科大学附属医院急诊医学科，贵阳 550004；2.贵州医科大学病理生理学教研室，贵阳 550000)

[摘要] 目的 探讨立体定向微创颅内血肿清除术(MIS)后病灶区灌注罗格列酮(RSG)对家兔脑出血(ICH)模型血肿周围继发性脑损伤的作用。方法 60只家兔分为4组，分别为模型对照组(MC组)、罗格列酮组(RSG组)、微创手术组(MIS组)和微创手术+罗格列酮组(MIS+RSG组)。各组家兔均制作ICH模型，MC组及RSG组在模型制作成功后6 h模拟手术过程进行假性血肿清除，RSG组病灶区灌注RSG，MIS组及MIS+RSG组进行微创血肿清除，MIS+RSG组随后病灶区灌注RSG，于实施相关处理后第7天对各组家兔进行神经功能缺损(Purdy)评分并处死，取血肿周围脑组织检测过氧化物酶体增殖物激或受体γ(PPARγ)水平及血脑屏障(BBB)通透性。结果 MC组Purdy评分、BBB通透性明显高于其他组，提示颅内血肿损害神经功能并破坏BBB通透性；与MC组相比，RSG组及MIS+RSG组的PPARγ表达显著增加，而MIS组PPARγ表达减少，提示RSG能明显增加PPARγ的表达，而微创清除颅内血肿后则可减少PPARγ的产生；与MC组比较，RSG组及MIS组血肿周围伊文思蓝(EB)水平显著降低，提示RSG治疗及MIS均可降低BBB通透性，MIS+RSG组EB含量降低更为明显，提示MIS后病灶区灌注RSG降低BBB通透性的效果更加明显。结论 MIS后病灶区灌注PPARγ激动剂RSG能有效减少家兔ICH模型继发性脑组织损伤，改善神经功能。

脑出血；罗格列酮；过氧化物酶体增殖物激活受体γ；血性，硬膜外，颅内；血脑屏障;继发性脑损伤

2.DepartmentofPathophysiology,GuizhouMedicalUnivesity,Guiyang,Guizhou550000,China)

[Abstract] Objective To observe the effects of rosiglitazone(RSG)infusion therapy following minimal invasive surgery(MIS)for intracerebral hemorrhage(ICH)evacuation on perihematomal secondary brain injury in rabbits.Methods A total of 60 rabbits were randomly assigned to a model control group(MC group),a RSG medication group(RSG group),a minimally invasive surgery group(MIS group)and a MIS combined with RSG group(MIS+RSG group).An ICH was induced in all rabbits.The MC group and the RSG group just received a sham minimally invasive procedures at 6 h after the ICH model was prepared successfully.The RSG group perfused RSG to the perihematomal brain tissues.A MIS was performed in the MIS group and the MIS+RSG group.RSG infusion therapy following MIS in the MIS+RSG group.All rabbits were killed on the 7th d after the relative processes were performed successfully.Neurological deficit scores were determined,and the perihematomal brain tissues were obtained to determine the PPARγ and the blood-brain barrier(BBB)permeability.Results The neurological deficit scores,the BBB permeability were increased in the MC group when compared to the other groups,these results showed that the ICH disrupted BBB and damaged neurological function.The PPARγ were all significantly increased in the RSG group and the MIS+RSG group,but decreased in the MIS group compared with the MC group,these results showed that RSG could increased in the expression of the PPARγ levels but decreased after MIS for ICH.The Evan′s Blue(EB)were decreased in the RSG group and the MIS group compared with the MC group which means RSG medication and the MIS could decreased the BBB permeability.The MIS+RSG group had a remarkable results.The MIS+RSG group displayed a great decrease in BBB permeability.Conclusion Performing the MIS followed by PPARγ agonist RSG might be more efficacious for reducing secondary brain injury and improving the neurological function for ICH model in rabbits.

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)引起的脑损伤分为两个阶段。第一阶段为0～4 h内，主要为血肿引起的机械性损伤,血肿挤压周围神经元和胶质细胞导致细胞死亡。第二阶段为4 h至7 d，主要为血肿引起的继发性脑损伤,红细胞(RBC)渗入脑组织,裂解释放细胞毒性物质引起炎性反应和氧化应激损伤[1-2]。微创血肿清除术(minimal invasive surgery，MIS)能有效清除血肿,降低血肿机械性压迫引起的脑损伤[3-5]，但很难清除渗入血肿周围脑组织的RBC及其裂解产生的细胞毒性物质，治疗ICH引起的继发性脑损伤程度有限。据此推论，MIS后血肿区灌注能增强小胶质细胞/吞噬细胞吞噬能力的药物有可能是一种值得探讨的治疗方案[1,6]。Wu等[4]的研究表明，实施MIS的最佳时间窗是ICH后6 h左右。这正是血肿引起继发性脑损伤的开始阶段。清除血肿及渗入血肿周围脑组织的RBC及其裂解产生的细胞毒性物质能有效减少炎性反应及继发性脑损伤[1]。

在激活小胶质细胞/巨噬细胞和降低氧化应激方面，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)通过转录水平的调控上调细胞表面清道夫受体CD36，从而帮助小胶质细胞/巨噬细胞通过吞噬或内吞来清除坏死或凋亡细胞残骸[6-7]。

罗格列酮(RSG)是PPARγ的高亲和性激动剂[8]，Zhao等[7]报道RSG促进大鼠ICH血肿分解，减少神经细胞损害，促进神经功能恢复，提出RSG通过PPARγ激活小胶质细胞/巨噬细胞可作为治疗ICH的一个靶点。Wu等[5]报道ICH后金属基质蛋白酶-9(MMP-9)表达增加，在血脑屏障(BBB)损害中起重要作用，MIS可以减少MMP-9的表达，降低BBB通透性，RSG则通过PPARγ下调MMP-9的表达[9]，减少BBB通透性,均有助于减少ICH后继发性脑损伤。

本研究以家兔神经功能评分、血肿周围脑组织PPARγ水平及BBB通透性为指标，观察MIS后病灶区灌注RSG对家兔ICH模型血肿周围继发性脑损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Trizol试剂、Tris-HCl、乙二胺四乙酸四钠(EDTA)、荧光PCR试剂盒(上海Sangong生物技术有限公司)；甲酰胺(重庆化学试剂厂)；伊文思蓝(EB,北京恒业中原化工公司)；4%多聚甲醛(武汉博士德生物科技公司)；尿激酶(广东Livzon制药有限公司)。

1.2 主要仪器 ZH-蓝星B型兔脑立体定位仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)；电子天平(德国Satourious)；彩虹-722型光栅分光光度计(山东高密彩虹分析仪器)；5415 R高速离心机(贺利氏公司)；DK系列数显恒温水浴锅(金坛市科析仪器有限公司)；MDF-382E型-80 ℃超低温冰箱(美国佛罗里达州Harris公司)；Step One型荧光定量PCR仪(美国加州ABI公司)。

1.3 实验动物分组 本研究得到贵州医科大学实验动物伦理委员会的批准。健康雄性家兔60只(体质量2.8～3.4 kg)，由贵州医科大学实验动物中心提供。分为模型对照组(MC组，n=15)、罗格列酮组(RSG组，n=15)，微创手术组(MIS组，n=15)和微创手术+罗格列酮组(MIS+RSG组，n=15)。

1.4 家兔脑出血模型的建立 家兔ICH模型的制作参照文献[3-5]。耳缘静脉注射20%氨甲基酸乙酯(1 mL/kg)麻醉家兔后固定于兔脑定位仪上，颅顶脱毛并用碘伏消毒手术区域。切开皮肤分离至骨膜，暴露前囟和人字形骨缝，于AP：1 mm，L：6 mm处钻孔。从耳中动脉取自体血(不抗凝)，用7号针头缓慢注射0.3 mL血液到家兔脑基底节区(12 mm深处)。注血时间持续3 min，针头置于原位8 min以防止血液回流，缓慢拔出针头。肌内注射青霉素(40万U)防止感染。3 h后进行兔脑CT扫描，如基底节区出现高密度影而侧脑室无高密度影则表明ICH模型制作成功(图1A)。排除标准为血液沿针道反流、血液进入侧脑室及家兔死亡。

1.5 MIS清除血肿 模型制作成功后6 h再次麻醉家兔，固定在兔脑立体定位仪上，7号针头沿制模时的针道插入血肿位置，通过负压轻吸出部分血肿，再在血肿位置注入5 000 U尿激酶(溶于0.1 mL生理盐水中)，针头置于原位1 h后缓慢抽吸。MC组及RSG组模拟MIS过程,但不清除血肿也不注入尿激酶。MC组注入0.1 mL生理盐水；RSG组血肿区灌注RSG 0.5 mg(溶于0.1 mL生理盐水中)；MIS组MIS后血肿区灌注等量生理盐水；MIS+RSG组在MIS后血肿区灌注RSG 0.5 mg(溶于0.1 mL生理盐水中)。针头均保持原位15 min后缓慢拔出。所有家兔均肌肉注射青霉素(40万U)预防感染。

A：箭头所示高密度影为颅内血肿；B：箭头所示血肿已基本清除。

图1 头颅CT显示MIS前后颅内血肿变化情况

1.6 脑组织标本的制备 各组家兔在实施相关处理后第7天处死。处死前2 h耳缘静脉注射2% EB(2 mL/kg)，2 h后麻醉家兔，迅速开胸暴露心脏，从左心室插管至主动脉根部，在右心耳上剪一小口作出口，快速灌注生理盐水2 000 mL直至流出液变清亮，再换4%的多聚甲醛1 000 mL快速灌注，该过程约需30 min。迅速断头取脑，置于冰盘，以针道为中心，切取血肿周围约0.5 cm范围内脑组织，置于-80 ℃冰箱中备用。

1.7 观察指标

1.7.1 血肿体积评估 家兔处死前2 h再次行头颅CT扫描评估MIS效果。血肿量用Tada公式计算：[π/6×血肿长度(mm)×血肿宽度(mm)×血肿高度(mm)]。

1.7.2 神经功能缺损(Purdy)评分[10]第7天对各组家兔神经功能缺损情况进行评分，用Purcly评分的方法对家兔进行意识、行为、转头、转圈、偏盲等情况进行评分。最高分为2分，为完全正常；最低分为11分，为动物死亡或意识完全丧失。运动功能 1～4分，意识清醒1～4分，转头0～1分，转圈0～1分，偏盲0～1分。

1.7.3 实时荧光定量PCR(real time-PCR)检测PPARγ mRNA 在家兔脑组织中的表达 采用Trizol试剂一步法提取脑组织总RNA，然后利用Superscript Ⅱ反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。引物用Primer5程序设计，序列如下：PPARγ引物正向5′-TTG TGA GCC TTG ACT TGA ACG ACC-3′、反向5′-CAT GAA GCC TTG TCC CTC CGA TA-3′。Tm(℃)75.29 ℃，扩增长度128 bp，β-actin引物正向5′-AGA TCG TGC GGG ACA TCA AG-3′,反向5′-CAG GAA GGA GGG CTG GAA GA-3′。Tm(℃)84.42 ℃，扩增长度181 bp。根据公式2-△△Ct计算出2-△△Ct值，用于检测PPARγmRNA相对表达量，2-△△Ct值反映了样本mRNA与内参基因β-actin mRNA的差异。

表1 各组家兔ICH模型MIS及RSG治疗后PPARγ mRNA、BBB通透性及Purdy评分的变化

1.7.4 BBB通透性 BBB通透性通过EB作为追踪剂来评价。各组家兔于处死前2 h经耳缘静脉将2%EB溶液(2 mL/kg)注入家兔血液中,2 h后按照脑组织标本制备方法快速断头取脑，取血肿周边组织并称质量(精确到0.1 mg)，置于盛3 mL甲酰胺的测试管中,使用甲酰胺方法测量脑组织EB含量来衡量BBB破坏的严重程度。公式如下：脑组织EB水平(μg/g，湿质量)=B×甲酰胺(mL)/湿质量(g)，B指根据标准曲线的线性回归方程得出的样本EB水平(μg/mL)。

2 结 果

2.1 血肿体积评估 MIS术前各组家兔颅内血肿量无显著差异，术后3 d复查头颅CT提示MIS后家兔颅内血肿量明显减少，MIS组及MIS+RSG组与MC组及RSG组比较差异有统计学意义(图1B)，血肿量变化与笔者先前发表的论文类似[4]。

2.2 Purdy评分 MC组神经功能缺损明显，MIS组及MIS+RSG组与MC组相比，Purdy评分显著减少，见表1，表明MIS后神经功能有所改善，而MIS+RSG组改善更加明显。

2.3 家兔血肿周围脑组组PPARγ mRNA表达 与MC组相比，RSG组及MIS+RSG组的PPARγ mRNA显著增加，而MIS组PPARγ表达减少，提示RSG能明显增加PPARγ的表达，而MIS后则可减少PPARγ的产生；MIS+RSG组PPARγ表达高于MC组、RSG组及MIS组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1、图2。

a:P<0.05，b:P<0.01。

图2 MIS及RSG治疗对各组家兔血肿周围脑组织PPARγ表达的影响

2.4 BBB通透性的变化 与MC组比较，RSG组及MIS组血肿周围EB水平显著降低，提示RSG治疗及MIS均可降低BBB通透性。MIS+RSG组EB水平降低更为明显，提示MIS后病灶区灌注RSG降低BBB通透性效果更加显著，见表1、图3。

a:P<0.05，b:P<0.01。

图3 MIS及RSG治疗对各组家免脑组织BBB通透性的影响

3 讨 论

ICH是全球重大公共健康问题，占卒中类型的10%～15%，发病率及病死率均高，幸存者常常遗留神经功能残疾，目前仍然没有行之有效的治疗方法[1-2]。近年来，MIS因其提高患者生存率，减少并发症而成为除了开颅手术之外的另一种选择[4]。虽然MIS能有效清除颅内血肿，解除血肿对脑组织的机械压迫，但是不能清除渗入到血肿周围脑组织的RBC及其裂解产生的细胞毒性物质，因而对继发性脑损害的作用有限。越来越多的证据表明炎性反应是ICH后导致继发性脑损伤的关键因素。RBC裂解释放的血红蛋白、亚铁血红素、亚铁离子等细胞毒性物质需要及时清除以消除其细胞毒性作用[2]。因此，笔者推测MIS清除血肿后病灶区灌注能增强小胶质细胞/巨噬细胞吞噬功能的药物是治疗ICH的潜在靶点[6]。

研究证明MIS清除血肿后能减轻BBB通透性，但术后的继发性脑损伤仍然很严重[5,11]。近期研究显示了PPARγ在ICH中的作用。PPARγ是一种核激素受体，与其配体结合后通过抑制 NF-κB来降低炎性反应；还可启动核内靶基因的转录来调节脂类和糖代谢及细胞的抗氧化机能[12]。小胶质细胞/巨噬细胞通过细胞表面清道夫受体CD36介导的RBC内吞作用是清除颅内血肿后渗入血肿周围脑组织的RBC的主要途径[2,13]。激活PPARγ可通过转录水平的调控上调CD36，从而帮助小胶质细胞/巨噬细胞通过吞噬或内吞作用来清除RBC[6-7]。

RSG临床用于治疗2型糖尿病，其作用机制是激活PPARγ受体，上调某些基因的表达从而增加外周组织对胰岛素的敏感性，因此，RSG是高效的PPARγ激动剂[14]。在治疗ICH方面，RSG通过上调PPARγ的表达，下调MMP-9水平[9]，减少BBB通透性，减轻脑水肿。

在MC组，血肿存在占位效应，RBC裂解产生的细胞毒性物质渗入血肿周围脑组织，导致脑组织损伤，表现为严重的BBB通透性增加。血肿刺激脑组织产生更多的PPARγ预防或限制脑组织损害，因此，与MIS组比较，PPARγ显著增加。

在MIS组，血肿占位效应被解除，细胞毒性物质如MMP-9减少，血肿周围炎性反应过程被抑制，脑组织无需产生更多的PPARγ来减少ICH后炎性损害。因此，MIS组PPARγ水平与MC组比较显著减少。

在MIS+RSG 组，PPARγ水平增加，EB水平显著下降，表明MIS后病灶区灌注RSG能更有效地减轻继发性脑损害。笔者先前发表的文献表明MIS能减少MMP-9水平，减轻继发性脑损伤[9]。Zhao等[7]报道PPARγ在促进血肿吸收和保护脑细胞免受血肿损害方面扮演了重要的角色。本研究中，MIS后病灶区灌注PPARγ激动剂RSG得到了肯定的结果。这种治疗措施是否比目前临床上治疗ICH的方法对患者有益，是转化医学研究所面临的课题。

综上所述，MIS后病灶区灌注PPARγ激动剂RSG使PPARγ水平增加，BBB通透性减少，能有效减少继发性脑组织损伤，改善神经功能。

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Effects of rosiglitazone infusion therapy following minimal invasive surgery for intracerebral hemorrhage evacuation on perihematomal secondary brain injury in rabbits*

RenSiying1，YangQin2，WuGuofeng1△，ZhangYan1，LiJun1

(1.DepartmentofEmergency,theAffiliateHospitalofGuizhouMedicalUniversity，Guiyang，Guizhou550004，China；

intracerebral hemorrhage；rosiglitazone；peroxisome proliferator-activated receptor γ；hematoma,epidural,cranial；blood-brain barrier；secondary brain injury

� 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.003

国家自然科学基金资助项目(81460185/H09106)。 作者简介：任思颖(1965-)，副主任医师，硕士，主要从事脑血管疾病研究。△

R743.34

A

1671-8348(2016)28-3896-04

2016-06-13

2016-07-21)